OCT4在胚胎早期發(fā)育,尤其是維持細(xì)胞多能性等方面具有重要調(diào)節(jié)作用。斑馬魚是重要的模式生物,建立熒光標(biāo)記oct4基因魚為開展魚類干細(xì)胞研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本文通過構(gòu)建帶有TOL2轉(zhuǎn)座子的PBLK-oct4-EGFP質(zhì)粒,獲得了綠色熒光標(biāo)記oct4基因的轉(zhuǎn)基因魚(F0代);結(jié)合雌核發(fā)育技術(shù),建立了一種快速制備純合轉(zhuǎn)基因魚的方法。具體研究結(jié)果如下:1、克隆斑馬魚oct4基因的啟動(dòng)子片段,對(duì)PBLK質(zhì)粒骨架和帶有oct4啟動(dòng)子的pMD18-T-oct4質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切,利用T4連接酶將oct4啟動(dòng)子連接到酶切后的PBLK質(zhì)粒上,成功構(gòu)建了全長為7338bp的帶有TOL2轉(zhuǎn)座子的PBLK-oct4-EGFP融合蛋白質(zhì)粒。2、將PBLK-oct4-EGFP質(zhì)粒和TOL2轉(zhuǎn)座酶mRNA混合液顯微注入斑馬魚受精卵中,獲得約53%的綠色熒光胚胎(F0代)。熒光定量PCR對(duì)oct4和egfp基因在F0代胚胎中的表達(dá)分析表明:斑馬魚oct4基因具有母源性基因表達(dá)的特點(diǎn),合子核基因在囊胚期表達(dá)旺盛,隨著胚胎細(xì)胞的分化,oct4基因表達(dá)量隨之降低。篩選到的F0代斑馬魚卵巢組織中的卵細(xì)胞及產(chǎn)出卵子中均可觀察到...

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 Oct4基因研究進(jìn)展
        1.1.1 Oct4基因的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 Oct4基因的生物學(xué)功能
    1.2 綠色熒光蛋白基因研究進(jìn)展
        1.2.1 綠色熒光蛋白基因的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)
        1.2.2 綠色熒光蛋白基因的應(yīng)用
    1.3 轉(zhuǎn)基因魚研究
        1.3.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究意義及現(xiàn)狀
        1.3.2 轉(zhuǎn)基因魚的制備方法
        1.3.3 Tol2轉(zhuǎn)座子及其應(yīng)用
    1.4 研究目的和意義
第二章 材料及方法
    2.1 斑馬魚和紅鯽的人工繁殖及胚胎培育
        2.1.1 斑馬魚的人工繁殖及胚胎培育
        2.1.2 紅鯽的人工繁殖及胚胎培育
    2.2 斑馬魚oct4基因啟動(dòng)子的獲取
        2.2.1 斑馬魚尾鰭DNA提取
        2.2.2 PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子及PCR產(chǎn)物純化
    2.3 PBLK-oct4-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        2.3.1 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)
        2.3.2 酶連反應(yīng)
        2.3.3 重組PBLK-oct4-EGFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.3.4 菌落PCR
        2.3.5 測序
        2.3.6 質(zhì)粒擴(kuò)增
        2.3.7 小提質(zhì)粒
    2.4 轉(zhuǎn)座酶mRNA的制備
        2.4.1 pCS-TP質(zhì)粒酶切
        2.4.2 體外轉(zhuǎn)錄
    2.5 顯微注射
    2.6 egfp和 oct基因在早期胚胎的表達(dá)量檢測
        2.6.1 提取及檢測總RNA
        2.6.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA
        2.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
    2.7 冰凍切片
    2.8 斑馬魚的雌核發(fā)育方法
        2.8.1 紅鯽精子的滅活
        2.8.2 斑馬魚的雌核發(fā)育及倍性操作
        2.8.3 斑馬魚的雌核發(fā)育的鑒定
    2.9 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.9.1 細(xì)胞培養(yǎng)基
        2.9.2 細(xì)胞的原代培養(yǎng)
        2.9.3 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        2.9.4 細(xì)胞的凍存
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 獲得PBLK-oct4-EGFP融合蛋白表達(dá)載體
        3.1.1 構(gòu)建PBLK-oct4-EGFP質(zhì)粒
        3.1.2 TOL2 轉(zhuǎn)座酶m RNA的制備
    3.2 Tg(oct4:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚F0 代的建立
        3.2.1 顯微注射后斑馬魚胚胎發(fā)育觀察
        3.2.2 egfp和 oct4 基因在早期胚胎的表達(dá)量分析
        3.2.3 轉(zhuǎn)基因斑馬魚F0代的篩選及鑒定
    3.3 Tg(oct4:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚雌核發(fā)育F1 代純合體的建立與鑒定
        3.3.1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚雌核發(fā)育F1代的制備
        3.3.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚雌核發(fā)育F1代純合個(gè)體的鑒定..
    3.4 Tg(oct4:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚純合個(gè)體尾鰭細(xì)胞系的建立
第四章 討論與總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3786873