本文關(guān)鍵詞：斑馬魚消化器官發(fā)育缺陷突變體的遺傳篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：作為脊椎動物體內(nèi)非常重要的系統(tǒng)之一,消化系統(tǒng),一直以來都是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點。消化系統(tǒng)能否正常發(fā)揮生理功能關(guān)乎到個體的健康,一些嚴(yán)重的消化系統(tǒng)疾病直接威脅著人們的健康。消化系統(tǒng)由消化道和消化腺組成。肝臟、膽囊、腸道等都是非常重要的消化器官,影響著食物消化、貯存、吸收營養(yǎng)、排泄和內(nèi)分泌等各個方面。研究消化器官的發(fā)育過程,有助于人們了解消化器官的分子發(fā)育機制進而了解一些先天性消化器官發(fā)育缺陷疾病的分子機制,比如先天性肝硬化、先天性肝內(nèi)膽管閉鎖、巨結(jié)腸癥,十二指腸閉鎖癥等。由于這些先天性疾病的患者通常在胚胎期或者嬰兒期就會過早的死亡,這使得在研究先天性消化器官發(fā)育缺陷分子機制上缺少必要的臨床案例和疾病家系。斑馬魚為小型亞熱帶淡水魚類,是在脊椎動物中具有代表性的模式動物。它在基因組層面上與人類、小鼠等高等哺乳動物相似度極高。斑馬魚的消化器官包括肝臟、膽囊、腸道等,與高等脊椎動物結(jié)構(gòu)上類似。長期以來,斑馬魚因其具有體外受精、胚胎透明和遺傳操作方便等獨特優(yōu)勢,成為研究脊椎動物胚胎發(fā)育的理想模型。斑馬魚易于飼養(yǎng),并在三個月左右達到性成熟。雌魚每周可產(chǎn)數(shù)百粒卵,非常適合作大規(guī)模遺傳篩選。腸道、肝臟和膽囊都發(fā)育自內(nèi)胚層,但是我們對于三者發(fā)育過程中分子機制的聯(lián)系和差異并不清楚。為了探究這個問題,我們利用斑馬魚為模式動物進行無基因差別的正向遺傳篩選,獲得相應(yīng)消化器官發(fā)育缺陷的突變體,同時利用二代測序方法篩選野生型斑馬魚體內(nèi)這些消化器官的組織特異性基因。主要研究內(nèi)容為：1.正向遺傳篩選斑馬魚消化器官發(fā)育缺陷突變體,首先是ENU誘變野生型斑馬魚與F1的生產(chǎn)及F2篩選家族的建立,其次是F2家族的遺傳篩選及突變體的傳代,最后是F3家族的遺傳篩選及候選突變體表型分型：2.消化器官轉(zhuǎn)錄組分析、特異性基因鑒定等研究,首先我們提取野生型斑馬魚消化器官樣品RNA,然后送公司測序,最后對公司的數(shù)據(jù)進行分析篩選找出組織特異性的表達基因并做進一步的探究。斑馬魚消化器官發(fā)育缺陷突變體正向遺傳篩選的研究,可以獲得相應(yīng)消化器官發(fā)育缺陷的動物模型,這將有助于深入了解斑馬魚消化器官分子發(fā)育的過程以及不同消化器官之間分子發(fā)育的聯(lián)系；斑馬魚消化器官轉(zhuǎn)錄組測序有助于探尋各消化器官之間時空表達特異性的基因,為研究該消化器官分子發(fā)育過程提供重要證據(jù)。在正向遺傳篩選中,我們采取經(jīng)典的ENU誘變流程和三代法篩選策略。在F2家族篩選中,家族內(nèi)部雌雄個體相互交配的方法產(chǎn)生F3子代,我們利用Ifabp探針原位雜交和BES-H2O2-Ac染色的方法觀察確定肝臟、膽囊和腸道在F3子代的表型,根據(jù)孟德爾遺傳定律判定其父母是不是雜合突變體,將觀察到有發(fā)育缺陷的且符合遺傳定律的定為候選突變體。然后將F2代篩選獲得的候選突變體與野生型雜交產(chǎn)生F3家族,采用同樣的篩選方法在F3家族中驗證F2代候選突變體的表型是否可遺傳,如可穩(wěn)定遺傳則定義為F3候選突變體。根據(jù)突變體的表型(結(jié)合同期檢測的肝臟、腸道、膽囊等表型),相同或相似的歸為一類。最終,我們在128個突變基因組篩選中篩出了源自14個F2家族的40對(最終存活34對)斑馬魚消化器官發(fā)育缺陷候選突變體,并將候選突變體進行了表型歸類,確定為23個突變品系,大致分成了以下6種突變類型,第一類被稱為“腸道特異性缺陷突變體”,有1個突變品系屬于這一類型；第二類被稱為“肝臟特異性缺陷突變體”,有6個突變品系屬于這一類型；第三類被稱為“膽囊特異性缺陷突變體”,有7個突變品系屬于這一類型；第四類被稱為“肝臟和膽囊共同發(fā)育缺陷突變體”,有1個突變品系屬于這一類型；第五類為“腸道和膽囊共同發(fā)育缺陷突變體”,有4個突變品系屬于這一類型；第六類被稱為“肝、腸、膽共同發(fā)育缺陷突變體”,有4個突變品系屬于這一類。在消化器官轉(zhuǎn)錄組測序中,我們利用二代測序的方法獲得了斑馬魚肝臟、膽囊、全腸、腸的不同節(jié)段(前腸、中腸、小腸、直腸和肛門)、胚胎期5dpf消化器官及身體組織、成魚消化器官及身體組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),并初步分析了腸的不同節(jié)段及身體組織的數(shù)據(jù),獲得了6種不同表達模式的基因歸類,分別代表身體、肛門、小腸、前中腸、中小腸特異高表達基因及消化道逐級降低表達基因,6個基因歸類的gene ontology分析,以及人類消化器官特異性高表達基因與測序數(shù)據(jù)的對比表明,斑馬魚的腸道與人類消化道的基因表達譜高度相似,但是斑馬魚沒有獨立結(jié)構(gòu)的胃,深入的分析及實驗驗證將在以后進行。同時我們又將肝臟、膽囊和腸道三者的差異表達基因進行了對比,分別找出了在這三種消化器官中上調(diào)和下調(diào)的組織特異性表達基因。最終,本研究通過遺傳篩選F2家族和F3家族,獲得肝臟、膽囊和腸道中具有穩(wěn)定遺傳的23個發(fā)育缺陷突變體,為探究消化器官發(fā)育過程中的分子機制提供了動物模型,未來將會挑選出2-3個突變體建立Mappings家族,通過后續(xù)圖位克隆找出突變基因以便探究其發(fā)育的分子機制；本研究通過消化器官轉(zhuǎn)錄組學(xué)的數(shù)據(jù)分析,篩選出若干在肝臟、膽囊和腸道中組織特異性表達的基因,今后會利用反向遺傳學(xué)手段(基因敲除)來研究其在相應(yīng)消化器官中的分子發(fā)育機制,同時結(jié)合正向遺傳篩選結(jié)果完善對相應(yīng)消化器官分子發(fā)育過程的認(rèn)識。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 ENU 遺傳篩選 突變體 轉(zhuǎn)錄組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q344
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 文獻綜述13-20
• 1.1 斑馬魚早期消化系統(tǒng)發(fā)育的研究進展13-17
• 1.1.1 斑馬魚肝臟發(fā)育的過程13-14
• 1.1.2 斑馬魚腸道發(fā)育的過程14-16
• 1.1.3 斑馬魚膽囊發(fā)育的過程16-17
• 1.2 遺傳誘變的介紹17-18
• 1.2.1 ENU誘變的簡介17
• 1.2.2 ENU誘變的特性與優(yōu)勢17-18
• 1.2.3 以斑馬魚作為模式生物及篩選材料的優(yōu)勢18
• 1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究進展18-20
• 1.3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)及比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述18-19
• 1.3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法的發(fā)展19-20
• 第二章 引言20-23
• 2.1 本研究工作的目的和意義20-21
• 2.2 本研究工作研究內(nèi)容和預(yù)期結(jié)果21-23
• 2.2.1 本研究工作的研究內(nèi)容21-22
• 2.2.2 本研究工作預(yù)期結(jié)果22-23
• 第三章 研究對象、實驗材料和研究方法23-47
• 3.1 斑馬魚品系及飼養(yǎng)23-24
• 3.1.1 斑馬魚簡介23
• 3.1.2 斑馬魚飼養(yǎng)23-24
• 3.2 實驗儀器、試劑以及耗材24-26
• 3.2.1 實驗儀器24-25
• 3.2.2 實驗試劑25
• 3.2.3 實驗耗材25-26
• 3.3 試劑配制26-31
• 3.3.1 全胚RNA原位雜交(Whole mount RNA in situ hybridization)相關(guān)試劑26-29
• 3.3.2 分子克隆操作相關(guān)試劑29-31
• 3.4 菌株和質(zhì)粒31
• 3.5 Taq DNA polymerase的制備與提純31-32
• 3.6 MgCl_2法制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞32
• 3.7 斑馬魚RNA的提取以及cDNA的合成32-34
• 3.7.1 斑馬魚RNA的提取32-33
• 3.7.2 斑馬魚1st-Strand cDNA合成33-34
• 3.8 含目的基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建34-39
• 3.8.1 擴增目的基因片段34
• 3.8.2 目的片段PCR產(chǎn)物純化34-36
• 3.8.3 T載體與目的片段連接重組36
• 3.8.4 重組子的轉(zhuǎn)化(Transformation)36-37
• 3.8.5 菌落PCR篩選陽性重組子37-38
• 3.8.6 陽性重組質(zhì)粒的純化38-39
• 3.8.7 重組質(zhì)粒的鑒定及測序39
• 3.9 用于原位雜交的反義RNA探針的制備39-41
• 3.9.1 線性化反義RNA探針模板39-40
• 3.9.2 純化RNA探針模板40-41
• 3.9.3 探針合成及純化41
• 3.10 斑馬魚早期胚胎RNA原位雜交(Whole mount RNA in situ hybridization)41-43
• 3.10.1 早期胚胎的收集、固定及保存41-42
• 3.10.2 全胚原位雜交流程42-43
• 3.11 ENU誘變及遺傳篩選流程43-45
• 3.11.1 ENU處理野生型斑馬魚43
• 3.11.2 ENU遺傳篩選的基本策略43-44
• 3.11.3 本研究中的遺傳篩選方法44-45
• 3.12 野生型斑馬魚消化器官轉(zhuǎn)錄組測序45-47
• 3.12.1 野生型斑馬魚消化器官RNA樣品獲取45
• 3.12.2 轉(zhuǎn)錄組測序基本策略及方法45-47
• 第四章 實驗結(jié)果47-56
• 4.1 篩選突變體方法的可行性驗證47-49
• 4.1.1 BES-H_2O_2-Ac在野生型斑馬魚體內(nèi)標(biāo)記情況47-48
• 4.1.2 lfabp探針合成及在野生型斑馬魚體內(nèi)的表達情況48-49
• 4.2 ENU誘變與F2家族的建立49-54
• 4.2.1 F2代篩選與突變體的傳代49-50
• 4.2.2 F3代建立與篩選50-51
• 4.2.3 F3突變體的表型分類51-54
• 4.3 消化器官轉(zhuǎn)錄組樣品獲取及初步分析54-56
• 4.3.1 斑馬魚消化器官轉(zhuǎn)錄組樣品獲取54
• 4.3.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的初步分析54-56
• 第五章 結(jié)果討論與分析56-58
• 5.1 ENU遺傳篩選工作成果討論56
• 5.2 ENU遺傳篩選過程中的一些問題56-58
• 第六章 結(jié)論與展望58-60
• 6.1 斑馬魚腸道、肝臟和膽囊突變體的正向遺傳篩選58
• 6.2 斑馬魚消化器官轉(zhuǎn)錄組測序58-60
• 參考文獻60-68
• 致謝68-70
• 附錄70-81
• 在讀期間發(fā)表論文及參與課題81
• 發(fā)表論文81
• 參與項目81
• 參與其他課題81

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