目的:在細胞水平探討PDK1對成骨細胞增殖過程的影響及其可能的影響機制,為了解成骨細胞增殖分化具體機制提供理論基礎(chǔ)。方法:選用小鼠成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1為研究對象,建立體外培養(yǎng)模型。將細胞分為三個培養(yǎng)組:C組,培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基;P+組,培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基+PDK1激活劑(10nM);P-組,培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基+PDK1抑制劑(10nM)。按以下順序進行培養(yǎng)和相關(guān)檢測:(1)成骨細胞培養(yǎng)體系鑒定:MC3T3-E1細胞系進行普通培養(yǎng)72h后,進行ALP染色;培養(yǎng)14天后,進行礦化結(jié)節(jié)染色。(2)對數(shù)增長期的確定:C組、P+組和P-組分別于24h、48h、72h、96h和120h進行細胞增殖檢測。(3)C組、P+組和P-組在培養(yǎng)72h后進行免疫熒光染色。(4)C組、P+組和P-組在培養(yǎng)72h后進行碘化丙啶染色,然后用流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡情況。(5)C組、P+組和P-組在培養(yǎng)72h后進行mRNA提取,RT-PCR法檢測Runx2和c-fos的表達。結(jié)果:(1)MC3T3-E1細胞系可以成功向成骨細胞分化。(2)72h時,C組、P+組和P-組細胞均處于對數(shù)增長期。(3)...

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1.前言
2.文獻綜述
    2.1 骨組織
    2.2 成骨細胞
        2.2.1 成骨細胞與骨疾病
        2.2.2 成骨細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)
        2.2.3 成骨細胞的發(fā)育過程
        2.2.4 成骨細胞增殖相關(guān)因素
    2.3 Runx2
        2.3.1 Runx2 的結(jié)構(gòu)
        2.3.2 Runx2 與成骨細胞
    2.4 c-fos
        2.4.1 c-fos的結(jié)構(gòu)
        2.4.2 c-fos與成骨細胞
    2.5 PDK1
        2.5.1 PDK1 的結(jié)構(gòu)
        2.5.2 PDK1 的功能
        2.5.3 PDK1對AGC家族激酶的調(diào)節(jié)
        2.5.4 PI3K/PDK1/Akt信號通路
        2.5.5 PDK1 抑制劑和激活劑
3.實驗對象及方法
    3.1 實驗材料和主要試劑
        3.1.1 實驗對象
        3.1.2 主要試劑及試劑來源
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞培養(yǎng)
        3.2.2 實驗分組及干預
        3.2.3 PDK1 抑制劑和激活劑的制備
        3.2.4 磷酸緩沖鹽溶液制備
        3.2.5 ALP染色
        3.2.6 礦化結(jié)節(jié)染色
        3.2.7 CCK8 細胞增殖檢測
        3.2.8 細胞周期檢測
        3.2.9 細胞骨架染色
        3.2.10 mRNA相對表達量檢測
    3.3 數(shù)據(jù)分析
4.實驗結(jié)果
    4.1 成骨細胞鑒定
    4.2 增殖曲線
    4.3 細胞免疫熒光染色
    4.4 細胞周期分布
    4.5 細胞凋亡情況
    4.6 Runx2的mRNA表達情況
    4.7 c-fos的 mRNA表達情況
5.分析與討論
    5.1 PDK1 影響成骨細胞增殖
    5.2 PDK1 影響成骨細胞增殖期Runx2 mRNA的表達
    5.3 PDK1 影響成骨細胞增殖期c-fos mRNA的表達
結(jié)論與展望
參考文獻
攻讀碩士學位期間科研工作
致謝



本文編號：3766898