目的:在細(xì)胞水平探討PDK1對成骨細(xì)胞增殖過程的影響及其可能的影響機(jī)制,為了解成骨細(xì)胞增殖分化具體機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法:選用小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1為研究對象,建立體外培養(yǎng)模型。將細(xì)胞分為三個培養(yǎng)組:C組,培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基;P+組,培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基+PDK1激活劑(10nM);P-組,培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基+PDK1抑制劑(10nM)。按以下順序進(jìn)行培養(yǎng)和相關(guān)檢測:(1)成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系鑒定:MC3T3-E1細(xì)胞系進(jìn)行普通培養(yǎng)72h后,進(jìn)行ALP染色;培養(yǎng)14天后,進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色。(2)對數(shù)增長期的確定:C組、P+組和P-組分別于24h、48h、72h、96h和120h進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。(3)C組、P+組和P-組在培養(yǎng)72h后進(jìn)行免疫熒光染色。(4)C組、P+組和P-組在培養(yǎng)72h后進(jìn)行碘化丙啶染色,然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。(5)C組、P+組和P-組在培養(yǎng)72h后進(jìn)行mRNA提取,RT-PCR法檢測Runx2和c-fos的表達(dá)。結(jié)果:(1)MC3T3-E1細(xì)胞系可以成功向成骨細(xì)胞分化。(2)72h時,C組、P+組和P-組細(xì)胞均處于對數(shù)增長期。(3)...

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1.前言
2.文獻(xiàn)綜述
    2.1 骨組織
    2.2 成骨細(xì)胞
        2.2.1 成骨細(xì)胞與骨疾病
        2.2.2 成骨細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)
        2.2.3 成骨細(xì)胞的發(fā)育過程
        2.2.4 成骨細(xì)胞增殖相關(guān)因素
    2.3 Runx2
        2.3.1 Runx2 的結(jié)構(gòu)
        2.3.2 Runx2 與成骨細(xì)胞
    2.4 c-fos
        2.4.1 c-fos的結(jié)構(gòu)
        2.4.2 c-fos與成骨細(xì)胞
    2.5 PDK1
        2.5.1 PDK1 的結(jié)構(gòu)
        2.5.2 PDK1 的功能
        2.5.3 PDK1對AGC家族激酶的調(diào)節(jié)
        2.5.4 PI3K/PDK1/Akt信號通路
        2.5.5 PDK1 抑制劑和激活劑
3.實(shí)驗(yàn)對象及方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)對象
        3.1.2 主要試劑及試劑來源
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)
        3.2.3 PDK1 抑制劑和激活劑的制備
        3.2.4 磷酸緩沖鹽溶液制備
        3.2.5 ALP染色
        3.2.6 礦化結(jié)節(jié)染色
        3.2.7 CCK8 細(xì)胞增殖檢測
        3.2.8 細(xì)胞周期檢測
        3.2.9 細(xì)胞骨架染色
        3.2.10 mRNA相對表達(dá)量檢測
    3.3 數(shù)據(jù)分析
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 成骨細(xì)胞鑒定
    4.2 增殖曲線
    4.3 細(xì)胞免疫熒光染色
    4.4 細(xì)胞周期分布
    4.5 細(xì)胞凋亡情況
    4.6 Runx2的mRNA表達(dá)情況
    4.7 c-fos的 mRNA表達(dá)情況
5.分析與討論
    5.1 PDK1 影響成骨細(xì)胞增殖
    5.2 PDK1 影響成骨細(xì)胞增殖期Runx2 mRNA的表達(dá)
    5.3 PDK1 影響成骨細(xì)胞增殖期c-fos mRNA的表達(dá)
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間科研工作
致謝



本文編號：3766898