菜心(Brassica rapa L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee)屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種,是中國南方的特產(chǎn)蔬菜,在每日蔬菜供應中占有重要地位。菜心的葉作為主要的食用部位,葉型的好壞直接決定著菜心的品質(zhì)和價值。在植物的葉和花發(fā)育等重要生命活動的進程中,TCP轉(zhuǎn)錄因子家族發(fā)揮著重要的作用,研究TCP基因家族的功能將為選育優(yōu)良葉型的白菜新品種奠定基礎。傳統(tǒng)的育種方法存在著許多局限性,而CRISPR-Cas9定向基因編輯系統(tǒng)能對特定的DNA片段實現(xiàn)編輯、插入和敲除,是目前最高效和便捷的基因編輯技術。CRISPR-Cas9系統(tǒng)在白菜類作物中的應用報道較少。本研究通過生物信息學分析鑒定了白菜中的TCP轉(zhuǎn)錄因子基因家族,并進行白菜愈傷組織再生體系的優(yōu)化和菜心CRISPR-Cas9遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步探索,為白菜CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的建立奠定基礎。得到如下實驗結(jié)果:1、白菜TCP轉(zhuǎn)錄因子基因家族的鑒定。通過BRAD網(wǎng)站獲取白菜TCP基因家族所有39個成員的CDS序列。通過BRAD和Phytozome分別整理白菜和擬南芥基因組中TCP家族的氨基...

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 TCP轉(zhuǎn)錄因子家族的研究進展
        1.1.1 TCP轉(zhuǎn)錄因子家族的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 TCP轉(zhuǎn)錄因子的特點
        1.1.3 TCP轉(zhuǎn)錄因子參與植物發(fā)育
        1.1.4 TCP轉(zhuǎn)錄因子的其他功能
    1.2 CRISRP-Cas9系統(tǒng)的研究進展
        1.2.1 CRISPR-CAS9的發(fā)現(xiàn)與應用
        1.2.2 CRISRP-Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與原理
        1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯后的鑒定
        1.2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢
    1.3 本課題的目的和意義
2 白菜TCP基因家族的鑒定
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 半定量PCR引物
        2.1.3 實驗儀器和試劑
    2.2 方法
        2.2.1 TCP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的鑒定和同源進化樹構(gòu)建
        2.2.2 利用Circos軟件定位基因
        2.2.3 菜心總RNA的提取和質(zhì)量檢測
        2.2.4 cDNA第一條鏈的合成
        2.2.5 半定量PCR檢測菜心TCP轉(zhuǎn)錄因子的表達
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 白菜TCP轉(zhuǎn)錄因子基因家族的鑒定
        2.3.2 白菜TCP轉(zhuǎn)錄因子基因家族進化樹的構(gòu)建與分析
        2.3.3 TCP基因家族的染色體定位與共線性關系
        2.3.4 白菜TCP基因家族在葉片發(fā)育和形態(tài)建成中的轉(zhuǎn)錄水平
    2.4 小結(jié)與討論
3 菜心不定芽再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 實驗儀器
        3.1.3 實驗試劑及配制
        3.1.4 培養(yǎng)基組成及配制
        3.1.5 菜心高頻不定芽再生體系所用的優(yōu)化培養(yǎng)基
        3.1.6 根癌農(nóng)桿菌介導的菜心遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化培養(yǎng)基
    3.2 方法
        3.2.1 菜心遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的初步探索
            3.2.1.1 種子的消毒處理
            3.2.1.2 外植體的獲取和培養(yǎng)
            3.2.1.3 不同濃度gelzan含量對于不定芽誘導的影響
            3.2.1.4 不同濃度AgNO₃對菜心不定芽誘導的影響
            3.2.1.5 不同激素組合對菜心不定芽誘導的影響
        3.2.3 菜心遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的初步探索
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 菜心不定芽再生體系的建立
            3.3.1.1 Gelzan植物凝膠對不定芽誘導的影響
            3.3.1.2 AgNO₃對菜心不定芽誘導的影響
            3.3.1.3 激素濃度對不定芽誘導的影響
        3.3.2 菜心遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
    3.4 小結(jié)
        3.4.1 菜心不定芽再生體系的建立
        3.4.2 菜心遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的初步探索
4 菜心CRISPR-Cas9系統(tǒng)的初步探索
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 質(zhì)粒和菌株
        4.1.3 TCP14基因的sgRNA1和sgRNA2和pAtU6引物的合成
        4.1.4 實驗儀器
        4.1.5 實驗試劑及配制
        4.1.6 大腸桿菌和農(nóng)桿菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基
    4.2 方法
        4.2.1 設計sgRNA靶標序列
        4.2.2 sgRNA Oligo二聚體的制備
        4.2.3 質(zhì)粒酶切與產(chǎn)物連接
        4.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)
        4.2.5 提取重組質(zhì)粒
        4.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(凍融法)
        4.2.7 菌液PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 CRISPR-Cas9載體的構(gòu)建
    4.4 小結(jié)
5 總結(jié)與討論
參考文獻
附錄
    附錄A 主要試劑
    附錄B 儀器
    附錄C 白菜TCP轉(zhuǎn)錄因子的信息和分類情況
    附錄D 本研究所用的引物
致謝



本文編號：3749594