發(fā)布時間：2017-05-18 02:07

  本文關(guān)鍵詞：釀酒酵母內(nèi)三對負相關(guān)基因的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在基因表達譜中,相關(guān)基因的表達常常會出現(xiàn)同時上調(diào)和下調(diào)的情況,且上調(diào)與下調(diào)的基因的數(shù)目相差不多,從數(shù)學(xué)角度對上調(diào)基因和下調(diào)基因的這種對應(yīng)關(guān)系進行了定性闡述,認(rèn)為它們是負相關(guān)的。據(jù)此,提出“負相關(guān)模式”這一概念,它是指如果基因集V中的兩個子集V1和V2在時間段T中具有相反的表達趨勢,而且每個子集之內(nèi)的基因都具有相似的表達趨勢,那么就可以說子集V1和子集V2是一個負相關(guān)模式。本課題組就此模式設(shè)計出NCFCA算法,并將其應(yīng)用于釀酒酵母細胞周期的基因表達譜和應(yīng)激響應(yīng)的表達數(shù)據(jù)集的研究中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)微小染色體維持蛋白基因與核心組蛋白基因,核糖體蛋白基因與熱休克蛋白基因,淀粉及蔗糖通路與嘌呤通路基因,這三對基因組可能符合負相關(guān)模式概念。本研究是基于上述關(guān)于基因“負相關(guān)模式”的理論計算結(jié)果的實驗驗證。采用了熒光實時定量PCR技術(shù),以穩(wěn)定表達的管家基因為內(nèi)參基因,分析三對負相關(guān)基因的動態(tài)表達情況,以探索它們之間的關(guān)系,以期為基因的負相關(guān)表達模式提供實驗支持。本研究中首先采用十三肽配型激素α因子、羥基尿、密度梯度離心法、饑餓誘導(dǎo)法同步細胞周期,檢測最優(yōu)同步方法。設(shè)計篩選內(nèi)參基因和6組基因的引物,優(yōu)化退火溫度,通過檢測擴增效率和相關(guān)系數(shù)值進一步驗證引物。經(jīng)ge Norm軟件分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,篩選穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因,用于目的基因的表達量矯正。根據(jù)三對負相關(guān)基因的不同表達信息,分別給予釀酒酵母不同的生長環(huán)境,定時提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成c DNA,再采用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測基因表達情況。然后對三對基因進行GO功能富集分析,最后分析三對負相關(guān)模式基因形成的原因。結(jié)果表明:α因子同步化處理效果最好;ge Norm軟件分析結(jié)果表明內(nèi)參基因ACT1和ALG9在本實驗條件下表達最穩(wěn)定,能校正目的基因的表達量;酵母中MCM2-7六個基因與核心組蛋白HHT1,HHT2,HHF1,HHF2,HTA2,HTA1,HTB2,HTB1八個基因共同參與了DNA構(gòu)象的變化、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的組裝、細胞大分子復(fù)合物的組裝、細胞成分的組裝和合成等生物過程,它們隨著細胞周期的進行而同時被上調(diào)或下調(diào),并且呈現(xiàn)出相反的趨勢。另外一對是熱休克蛋白基因(HSP104,HSP12,HSP26,HSP31,HSP42,HSP60,HSP78,HSP82)與核糖體蛋白基因(RPS5,RPS18A,RPS18B,RPS28A,RPS28B,RPL5,RPL18A,RPL18B,RPL35A,RPL35B),它們各自組內(nèi)均具有顯著的功能相似性,但是它們每兩組基因之間沒有功能上的相似性,兩組基因會隨著溫度的變化(升溫和降溫)進行上調(diào)和下調(diào),并且呈現(xiàn)出相反的趨勢。第三對是淀粉及蔗糖通路基因(GSY2,NTH1,GLC3,PGM2,TPS1,TPS2)與嘌呤通路基因(RNR1,ADE1,IMD3,IMD4,PRS2,PRS1,ADE13,PRS4,PRS3,PRS5,APT1,ADE6,ADE8,ADE2,ADE17,ADE4,AAH1),它們各自均具有顯著的功能相似性。但是在氧化應(yīng)激過程中表現(xiàn)出相反的表達模式,淀粉和蔗糖代謝通路基因的表達在氧化應(yīng)激中幾乎都是被激活的,而嘌呤代謝通路基因的表達在氧化應(yīng)激中都是被抑制的。此外,對于三對基因形成負相關(guān)模式的原因也作出了探討,它們分別是由Clb-Cdk1與TORC1的調(diào)控。綜上所述,實驗結(jié)果證明三對基因確實呈負相關(guān)模式,與本課題組理論計算結(jié)果相符,并發(fā)現(xiàn)其形成原因分別為Clb-Cdk1和TORC1在酵母細胞內(nèi)的調(diào)控作用,但具體的機制尚待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：釀酒酵母 負相關(guān)模式 細胞周期 應(yīng)激響應(yīng) 熒光實時定量PCR
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 1 緒論11-25
• 1.1 問題的提出及研究意義11-12
• 1.1.1 問題的提出11-12
• 1.1.2 研究意義12
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀12-20
• 1.2.1 負相關(guān)模式12-14
• 1.2.2 微小染色體維持蛋白（MCM）14-17
• 1.2.3 核心組蛋白（Core Histone）17-18
• 1.2.4 熱休克蛋白18-19
• 1.2.5 核糖體蛋白19-20
• 1.2.6 淀粉及蔗糖代謝通路20
• 1.3 本文研究的目的和研究內(nèi)容20-23
• 1.3.1 本文研究的目的20-21
• 1.3.2 本文研究的內(nèi)容21-23
• 1.4 本文的創(chuàng)新點23-25
• 2 酵母細胞周期同步化處理25-31
• 2.1 引言25
• 2.2 材料與儀器25-26
• 2.2.1 實驗材料25
• 2.2.2 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.2.3 主要試劑26
• 2.3 實驗方法和步驟26-27
• 2.3.1 不連續(xù)密度梯度離心法26
• 2.3.2 營養(yǎng)饑餓法26-27
• 2.3.3 α 因子處理27
• 2.3.4 羥基尿處理27
• 2.4 結(jié)果與分析27-29
• 2.5 本章小結(jié)29-31
• 3 酵母細胞周期內(nèi)MCM與核心組蛋白基因的表達分析31-59
• 3.1 引言31
• 3.2 材料與儀器31-32
• 3.2.1 實驗材料31
• 3.2.2 主要儀器設(shè)備31-32
• 3.2.3 主要試劑32
• 3.3 實驗方法和步驟32-37
• 3.3.1 引物的設(shè)計32-34
• 3.3.2 內(nèi)參基因PCR擴增條件的優(yōu)化34-35
• 3.3.3 釀酒酵母總RNA的提取35-36
• 3.3.4 c DNA第一鏈的合成36
• 3.3.5 q PCR反應(yīng)36
• 3.3.6 數(shù)據(jù)分析36
• 3.3.7 兩組基因功能富集分析36-37
• 3.4 結(jié)果與分析37-53
• 3.4.1 引物的設(shè)計37
• 3.4.2 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析37-38
• 3.4.3 熒光定量q PCR退火溫度的優(yōu)化38-39
• 3.4.4 總RNA質(zhì)量檢測39
• 3.4.5 MCM及核心組蛋白基因的表達情況39-40
• 3.4.6 兩組基因功能富集分析40-53
• 3.5 討論53-56
• 3.5.1 內(nèi)參基因的選擇53-54
• 3.5.2 微小染色體維持蛋白及核心組蛋白q PCR54
• 3.5.3 微小染色體維持蛋白及核心組蛋白功能富集分析54
• 3.5.4 微小染色體維持蛋白及核心組蛋白形成負相關(guān)模式的原因54-56
• 3.6 本章小結(jié)56-59
• 4 酵母細胞內(nèi)核糖體蛋白與熱休克蛋白基因的表達分析59-73
• 4.1 引言59
• 4.2 材料和儀器59-60
• 4.2.1 實驗材料59
• 4.2.2 主要儀器設(shè)備59-60
• 4.2.3 主要試劑60
• 4.3 實驗方法和步驟60-63
• 4.3.1 引物的設(shè)計與合成60-62
• 4.3.2 釀酒酵母總RNA的提取62
• 4.3.3c DNA第一鏈的合成62
• 4.3.4q PCR反應(yīng)62
• 4.3.5 兩組基因功能富集分析62-63
• 4.4 結(jié)果與分析63-68
• 4.4.1 總RNA質(zhì)量檢測63
• 4.4.2 核糖體蛋白與熱休克蛋白基因的表達情況63-64
• 4.4.3 核糖體蛋白與熱休克蛋白功能富集分析64-68
• 4.5 討論68-71
• 4.5.1 核糖體蛋白與熱休克蛋白基因q PCR68
• 4.5.2 核糖體蛋白與熱休克蛋白基因功能富集分析68-69
• 4.5.3 核糖體蛋白與熱休克蛋白基因負相關(guān)的形成原因分析69-71
• 4.6 本章小結(jié)71-73
• 5 酵母細胞內(nèi)淀粉及蔗糖通路與嘌呤通路基因的表達分析73-85
• 5.1 引言73
• 5.2 材料和儀器73-74
• 5.2.1 實驗材料73
• 5.2.2 主要儀器設(shè)備73-74
• 5.2.3 主要試劑74
• 5.3 實驗方法和步驟74-77
• 5.3.1 引物的設(shè)計與合成74-76
• 5.3.2 釀酒酵母總RNA的提取76
• 5.3.3c DNA第一鏈的合成76
• 5.3.4q PCR反應(yīng)76
• 5.3.5 兩組基因功能富集分析76-77
• 5.4 結(jié)果與分析77-81
• 5.4.1 總RNA質(zhì)量檢測77
• 5.4.2 淀粉和蔗糖代謝通路基因和嘌呤代謝通路基因的表達情況77-78
• 5.4.3 淀粉和蔗糖代謝通路基因及嘌呤代謝通路基因功能富集分析78-81
• 5.5 討論81-84
• 5.5.1 淀粉和蔗糖代謝通路基因及嘌呤代謝通路基因q PCR81-82
• 5.5.2 淀粉和蔗糖代謝通路基因及嘌呤代謝通路基因功能富集分析82
• 5.5.3 淀粉和蔗糖代謝通路基因及嘌呤代謝通路基因負相關(guān)的形成原因分析82-84
• 5.6 本章小結(jié)84-85
• 6 結(jié)論和展望85-89
• 6.1 釀酒酵母細胞周期同步化85
• 6.2 內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計85
• 6.3 三對“負相關(guān)基因”的表達情況85-86
• 6.4 三對負相關(guān)基因的功能富集分析情況86
• 6.5 MCM與Histone基因負相關(guān)模式形成原因86
• 6.6 核糖體蛋白與熱休克蛋白基因負相關(guān)模式形成原因86-87
• 6.7 淀粉和蔗糖通路與嘌呤代謝通路基因負相關(guān)模式形成原因87
• 6.8 后續(xù)工作的展望87-89
• 致謝89-91
• 參考文獻91-99
• 附錄99
• A作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄99

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  本文關(guān)鍵詞：釀酒酵母內(nèi)三對負相關(guān)基因的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374920