A型塞內(nèi)卡病毒(Seneca VriusA,SVA)屬于小RNA病毒科塞內(nèi)卡病毒屬,對(duì)豬具有傳染性和致病性。癥狀類似于口蹄疫、豬傳染性水皰病和豬水泡性口炎,成年豬感染初期出現(xiàn)嗜睡、厭食和發(fā)熱,隨后鼻鏡部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位出現(xiàn)大小不一的水皰,嚴(yán)重者造成潰爛和跛行。7日齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達(dá)70%,偶爾伴有腹瀉癥狀。2014-2015年SVA給巴西養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,同年SVA首次出現(xiàn)在我國(guó)廣東地區(qū),屬于新型外來病。常用檢測(cè)方法有病毒的分離鑒定、常規(guī)RT-PCR、熒光定量RT-PCR、病毒中和試驗(yàn)、利用表達(dá)SVA蛋白構(gòu)建ELISA等。SVA只有一個(gè)閱讀框,VP1、VP2和VP3構(gòu)成該病毒的衣殼蛋白。研究表明,以VP2蛋白作為包被抗原的ELISA檢測(cè)方法其特異性和靈敏度優(yōu)于包被抗原為VP1蛋白或VP3蛋白。本試驗(yàn)利用構(gòu)建的SVA-VP2蛋白作為抗原,建立SVA血清抗體間接ELISA和均相光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)(AlphaLISA)檢測(cè)方法,為SVA-VP2蛋白的免疫原性的研究及SVA血清學(xué)檢測(cè)試劑盒和基因工程疫苗研究奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)根據(jù)SVA分離株GD01/2017中的VP2基因,...

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫對(duì)照
1 引言
    1.1 A型塞內(nèi)卡病毒概述
        1.1.1 A型塞內(nèi)卡病毒國(guó)內(nèi)外的研究
        1.1.2 A型塞內(nèi)卡病毒的傳播途徑和傳染源
        1.1.3 A型塞內(nèi)卡病毒病的預(yù)防措施
        1.1.4 A型塞內(nèi)卡病毒的檢測(cè)方法
    1.2 AlphaLISA檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.2.1 均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)原理
        1.2.2 均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)特點(diǎn)
        1.2.3 均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究
        1.2.4 均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的研究
        1.2.5 均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在蛋白分子相互作用領(lǐng)域的研究
        1.2.6 均相光激化學(xué)發(fā)光免疫分析在疫病檢測(cè)領(lǐng)域的研究
    1.3 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)儀器
    2.2 試驗(yàn)材料與試劑
        2.2.1 細(xì)胞與病毒
        2.2.2 載體、菌株與血清樣品
        2.2.3 試驗(yàn)試劑與試劑盒
    2.3 主要試劑配制
        2.3.1 LB培養(yǎng)基制備
        2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑的配制
        2.3.3 蛋白表達(dá)及純化所需試劑配制
        2.3.4 Western blotting所需試劑配制
        2.3.5 AlphaLISA檢測(cè)方法所用試劑配制
    2.4 A型塞內(nèi)卡病毒VP2蛋白的原核表達(dá)與純化
        2.4.1 A型塞內(nèi)卡病毒VP2基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及VP2蛋白的誘導(dǎo)和純化
    2.5 A型塞內(nèi)卡病毒血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立
        2.5.1 間接ELISA方法的操作流程
        2.5.2 間接ELISA方法條件的優(yōu)化
    2.6 A型塞內(nèi)卡病毒AlphaLISA檢測(cè)方法建立
        2.6.1 抗原的生物素化
        2.6.2 抗體與受體微珠偶聯(lián)
        2.6.3 AlphLISA方法試驗(yàn)步驟
        2.6.4 AlphaLISA方法的建立
3 結(jié)果
    3.1 A型塞內(nèi)卡病毒VP2基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果
        3.1.1 A型塞內(nèi)卡病毒VP2片段的擴(kuò)增結(jié)果
        3.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
    3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及VP2蛋白的誘導(dǎo)和純化結(jié)果
        3.2.1 蛋白的表達(dá)結(jié)果
        3.2.2 蛋白表達(dá)的優(yōu)化結(jié)果
        3.2.3 蛋白質(zhì)可溶性分析
        3.2.4 蛋白純化
        3.2.5 Western-blot鑒定
        3.2.6 蛋白濃度測(cè)定
    3.3 A型塞內(nèi)卡病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立結(jié)果
        3.3.1 間接ELISA方法包被抗原和血清最佳反應(yīng)條件的確定
        3.3.2 辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的抗豬IgG反應(yīng)的最佳稀釋濃度
        3.3.3 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的確定
        3.3.4 間接ELISA最佳顯色時(shí)間的確定
        3.3.5 間接ELISA臨界值的確定
        3.3.6 特異性試驗(yàn)
        3.3.7 靈敏性試驗(yàn)
        3.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)
        3.3.9 臨床樣品的檢測(cè)
    3.4 A型塞內(nèi)卡病毒AlphaLISA檢測(cè)方法結(jié)果
        3.4.1 抗原和抗體最佳反應(yīng)濃度
        3.4.2 靈敏度的檢測(cè)
        3.4.3 特異性試驗(yàn)
        3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)
4 討論
    4.1 豬A型塞內(nèi)卡病毒及其危害
    4.2 A型塞內(nèi)卡病毒VP2蛋白的原核表達(dá)與純化
    4.3 A型塞內(nèi)卡病毒的檢測(cè)
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的論文
作者簡(jiǎn)歷
致謝
附件



本文編號(hào)：3748456