來源于乳酸菌的糖苷水解酶70家族(GH70)的葡聚蔗糖酶能夠以蔗糖為底物催化合成結(jié)構(gòu)多樣的a-葡聚糖。除了多糖和寡糖的合成,葡聚蔗糖酶還可以糖基化修飾帶有羥基的有機分子,并且具有廣泛的受體底物雜泛性。酚類化合物是一類普遍存在于植物中的具有芳香環(huán)羥基結(jié)構(gòu)的化合物,包括一元酚、二元酚和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多元酚,如黃酮類化合物、白藜蘆醇等。研究表明酚類化合物普遍具有抗氧化,抗腫瘤等生理功能。由于酚類化合物的低溶解度和低生物利用度等問題的存在,限制了其實際應(yīng)用。本論文探討利用來自昆氏乳桿菌(Lactobacillus kunkeei)的分支葡聚蔗糖酶糖基化修飾酚類化合物以改善其理化性質(zhì),從而為酶法規(guī)模化修飾此類化合物提供一定的理論指導(dǎo)和技術(shù)基礎(chǔ)。本論文主要取得如下研究成果:1.通過糖基化實驗研究表明,來自昆氏乳桿菌DSM 12361(L.kunkeei DSM12361)的分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2可以催化苯二酚(鄰苯二酚、間苯二酚與對苯二酚)的糖基化修飾,生成單糖基化和二糖基化化合物,且鄰苯二酚的糖基化效率最高。在1 M蔗糖的供體底物濃度下,鄰苯二酚、間苯二酚和對苯二酚濃度分別為200 mM、2...

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞(Abbreviation)
第一章 緒論
    1.1 GH70家族葡聚蔗糖酶的研究進展
        1.1.1 GH70家族典型葡聚蔗糖酶概述
        1.1.2 GH70家族酶的催化機制
        1.1.3 GH70家族葡聚蔗糖酶的結(jié)構(gòu)
        1.1.4 分支葡聚蔗糖酶
    1.2 酚類化合物及其應(yīng)用的研究進展
        1.2.1 苯二酚概述
        1.2.2 植物多酚的生理活性
    1.3 酚類化合物的糖基化修飾
        1.3.1 糖基化反應(yīng)概述
        1.3.2 常用于糖基化修飾的酶
        1.3.3 葡聚蔗糖酶糖基化修飾酚類物質(zhì)研究進展
        1.3.4 糖基化對苯二酚合成α-熊果苷研究進展
    1.4 立題依據(jù)及主要內(nèi)容
第二章 分支葡聚蔗糖酶糖基化修飾苯二酚
    2.1 實驗材料與方法
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件
        2.1.3 試劑和儀器
        2.1.4 分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2的表達
        2.1.5 分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2的純化
        2.1.6 分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2的酶活力測定
        2.1.7 HPLC檢測GtfZ-CD2糖基化修飾苯二酚反應(yīng)
        2.1.8 薄層層析檢測GtfZ-CD2糖基化修飾苯二酚反應(yīng)
        2.1.9 糖基化產(chǎn)物的純化
        2.1.10 LC-MS分析分支葡聚蔗糖酶糖基化修飾苯二酚的糖基化產(chǎn)物
        2.1.11 糖基化產(chǎn)物的核磁共振分析
        2.1.12 不同濃度苯二酚對分支葡聚蔗糖酶催化其糖基化的影響
        2.1.13 分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2酶動力學(xué)常數(shù)的測定
    2.2 結(jié)果與討論
        2.2.1 HPLC分析GtfZ-CD2糖基化修飾苯二酚產(chǎn)物
        2.2.2 苯二酚糖基化產(chǎn)物的純化和結(jié)構(gòu)解析
        2.2.3 受體底物濃度對葡聚蔗糖酶糖基化效率的影響
        2.2.4 分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2動力學(xué)常數(shù)
    2.3 本章小結(jié)
第三章 半理性定點突變分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2以提高其對苯二酚的糖基化修飾效率
    3.1 實驗材料與方法
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 本章所用的引物
        3.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件
        3.1.4 試劑和儀器
        3.1.5 GtfZ-CD2的同源模建和分子對接分析
        3.1.6 分支葡聚蔗糖酶突變體構(gòu)建實驗操作
        3.1.7 Gtf-CD2突變體糖基化苯二酚的初步篩選
    3.2 實驗結(jié)果與討論
        3.2.1 分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2同源模建
        3.2.2 分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2分子對接分析
        3.2.3 半理性突變優(yōu)化糖基化效率
    3.3 本章小結(jié)
第四章 響應(yīng)面分析優(yōu)化分支葡聚蔗糖酶糖基化修飾對苯二酚生產(chǎn)α-熊果苷產(chǎn)量
    4.1 實驗材料與方法
        4.1.1 α-熊果苷標準曲線的繪制
        4.1.2 單因素實驗
        4.1.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗
    4.2 實驗結(jié)果與討論
        4.2.1 單因素試驗結(jié)果
        4.2.2 響應(yīng)曲線優(yōu)化實驗設(shè)計及結(jié)果
        4.2.3 α-熊果苷產(chǎn)量實驗的顯著性檢驗
        4.2.4 不同因素間交互作用分析
        4.2.5 產(chǎn)量工藝優(yōu)化
    4.3 本章小結(jié)
第五章 分支葡聚蔗糖酶糖基化修飾不同多酚類化合物的初步分析
    5.1 實驗材料與方法
        5.1.1 試劑和儀器
        5.1.2 HPLC分析分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2糖基化修飾多酚類化合物
        5.1.3 GtfZ-CD2糖基化修飾多酚類化合物反應(yīng)進程分析
        5.1.4 LC-MS檢測糖基化產(chǎn)物
    5.2 結(jié)果與討論
        5.2.1 分支葡聚蔗糖酶糖基化修飾黃酮類化合物和白藜蘆醇效率
        5.2.2 HPLC及LC-MS分析分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2糖基化修飾黃酮類化合物和白藜蘆醇產(chǎn)物
        5.2.3 HPLC分析分支葡聚蔗糖酶GtfZ-CD2糖基化修飾黃酮類化合物和白藜蘆醇反應(yīng)進程分析
    5.3 本章小結(jié)
全文工作總結(jié)與展望
附圖表
參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
學(xué)位論文評閱及答辯情況表



本文編號：3743263