發(fā)布時(shí)間：2022-12-04 22:17

　　CRISPR/Cas系統(tǒng)作為第三代基因組編輯技術(shù),具有簡(jiǎn)單、高效、靈活、低廉等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于多個(gè)物種的基因組編輯研究中,成為了生命科學(xué)領(lǐng)域的革命性工具。利用該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組目標(biāo)位點(diǎn)的堿基插入、缺失、替換等操作,及靶向激活或抑制基因的表達(dá)。與此同時(shí),對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的不斷改造以及新型Cas蛋白的功能開(kāi)發(fā),使CRISPR系統(tǒng)正逐步成為一個(gè)理想的遺傳修飾工具。CRISPR-Cas12b/C2c1系統(tǒng)屬于class 2中的type V-B型的基因編輯系統(tǒng)。Cas12b蛋白具有一個(gè)保守的RuvC結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Nuc結(jié)構(gòu)域,該蛋白需要crRNA和tracrRNA的共同引導(dǎo),識(shí)別富含AT的PAM序列,切割DNA雙鏈,產(chǎn)生5’粘性末端。為了驗(yàn)證CRISPR-Cas12b系統(tǒng)能否在植物中起到基因組編輯的作用,我們選擇來(lái)自于Bacillussp.V3-13（Bv）和Bacillus hisashii（Bh）的Cas12b蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中進(jìn)行驗(yàn)證。首先,通過(guò)添加核定位信號(hào)和密碼子優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了兩蛋白在擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞中的入核表達(dá)。其次,選擇擬南芥PDS3、FLS2、GL2和TT4基因... 

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 課題背景
    1.2 基因組編輯的原理和類(lèi)型
    1.3 基因組編輯工具發(fā)展簡(jiǎn)述
        1.3.1 第一代基因組編輯工具-ZFN
        1.3.2 第二代基因組編輯工具-TALEN
        1.3.3 第三代基因組編輯工具-CRISPR-Cas
    1.4 基因組編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用
        1.4.1 ZFN在植物中的應(yīng)用
        1.4.2 TALEN在植物中的應(yīng)用
        1.4.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用
        1.4.4 新型基因組編輯工具CRISPR/Cas12b的研究現(xiàn)狀
    1.5 選題意義
第2章 Cas12b蛋白的密碼子優(yōu)化及植物中的表達(dá)驗(yàn)證
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 試劑與儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Cas12b蛋白的密碼子優(yōu)化及載體構(gòu)建
        2.2.2 Cas12b-EGFP 融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.3 Cas12b-EGFP融合蛋白在本生煙植株中的表達(dá)驗(yàn)證
        2.2.4 Cas12b-EGFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 Cas12b蛋白的密碼子優(yōu)化及載體構(gòu)建的結(jié)果與分析
        2.3.2 Cas12b-EGFP融合蛋白載體構(gòu)建的結(jié)果及分析
        2.3.3 Cas12b-EGFP融合蛋白在本生煙植株中的表達(dá)結(jié)果及分析
        2.3.4 Cas12b-EGFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的表達(dá)結(jié)果及分析
    2.4 本章小結(jié)
第3章 Cas12b蛋白的細(xì)胞水平基因組編輯功能驗(yàn)證
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 試劑與儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Cas12b蛋白單位點(diǎn)基因組編輯
        3.2.2 Cas12b蛋白雙位點(diǎn)基因組編輯
        3.2.3 Cas12b蛋白大片段缺失基因組編輯
        3.2.4 Cas12b蛋白脫靶效應(yīng)檢測(cè)
        3.2.5 深度測(cè)序結(jié)果分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 基因組編輯靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)結(jié)果及分析
        3.3.2 Cas12b蛋白單位點(diǎn)基因組編輯結(jié)果及分析
        3.3.3 Cas12b蛋白雙位點(diǎn)基因組編輯結(jié)果及分析
        3.3.4 Cas12b蛋白基因組編輯效率對(duì)比
        3.3.5 Cas12b蛋白大片段缺失基因組編輯結(jié)果及分析
        3.3.6 Cas12b蛋白脫靶效應(yīng)檢測(cè)
    3.4 本章小結(jié)
第4章 Cas12b蛋白的植株水平基因組編輯功能驗(yàn)證
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 試劑與儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 擬南芥長(zhǎng)日照植株的種植
        4.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
        4.2.3 T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的篩選及檢測(cè)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    4.4 本章小結(jié)
結(jié)論
附錄一
附錄二
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas植物基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 劉耀光,李構(gòu)思,張雅玲,陳樂(lè)天.  華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2019(05)



本文編號(hào)：3709090