近年來(lái),基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9在動(dòng)植物中都得到了廣泛應(yīng)用。在本研究中,利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),將與直鏈淀粉合成有關(guān)的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（Granule-Bound Starch SynthaseⅠ,GBSS I）作為基因組編輯的靶基因,以大西洋、隴薯三號(hào)和費(fèi)烏瑞它作為試驗(yàn)材料,通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化將體外合成的核糖核蛋白R(shí)NP和mRNA傳遞到外植體中,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的敲除,以獲得無(wú)外源DNA插入的馬鈴薯新品系。本研究以RNP為轉(zhuǎn)化試劑共獲得168株再生植株,其中有13株再生植株在靶位點(diǎn)處成功實(shí)現(xiàn)基因編輯,而以mRNA為轉(zhuǎn)化試劑的結(jié)果還未送測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)論:1)以隴薯三號(hào)莖段作為外植體分化的愈傷組織,結(jié)構(gòu)過(guò)于緊密,用基因槍轟擊的方式,未能將反應(yīng)試劑傳遞到愈傷組織中;2)以費(fèi)烏瑞它的莖段作為外植體分化形成的愈傷組織,由于結(jié)構(gòu)松散,導(dǎo)致后期不能分化成苗;3)以大西洋葉片和葉片愈傷組織作為基因槍實(shí)驗(yàn)的外植體,最終獲得GBSS I基因敲除的轉(zhuǎn)化株,基因編輯效率為0.039-0.36%。本研究說(shuō)明基于CRISPR/Cas9的基因槍技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)化RNP的方法可對(duì)馬鈴薯... 

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
一 前言
    1.1 基因組編輯的現(xiàn)狀與發(fā)展
        1.1.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)
        1.1.2 CRISPR/Cpf1 系統(tǒng)
        1.1.3 CRISPR/Cas13 系統(tǒng)
    1.2 基因組編輯技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展
        1.2.1 基因敲除或插入
        1.2.2 單堿基誘變
        1.2.3 核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的活細(xì)胞成像技術(shù)
    1.3 基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)育種上的應(yīng)用與發(fā)展
        1.3.1 增加農(nóng)作物產(chǎn)量
        1.3.2 提升農(nóng)作物品質(zhì)
        1.3.3 提高植物抗逆性
        1.3.4 加速雜交育種
    1.4 基因編輯在馬鈴薯上的研究進(jìn)展
        1.4.1 降低馬鈴薯龍葵素含量
        1.4.2 改善低溫糖化現(xiàn)象
        1.4.3 馬鈴薯抗除草劑
        1.4.4 提高馬鈴薯支鏈淀粉含量
        1.4.5 馬鈴薯抗多酚氧化酶(PPO)
        1.4.6 馬鈴薯抗病毒
        1.4.7 馬鈴薯克服自交不親和
    1.5 無(wú)轉(zhuǎn)基因成分且無(wú)轉(zhuǎn)基因過(guò)程的基因組編輯
        1.5.1 無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的基因組編輯
        1.5.2 無(wú)轉(zhuǎn)基因過(guò)程的基因組編輯
    1.6 研究目的和意義
    1.7 實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性
        1.7.1 技術(shù)創(chuàng)新
        1.7.2 材料創(chuàng)新
二 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試劑與工具酶
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 載體構(gòu)建
        2.2.2 陽(yáng)性菌株檢測(cè)
        2.2.3 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄及純化
        2.2.4 Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄及純化
        2.2.5 金粉懸濁液的配置
        2.2.6 RNP的金粉包裹
        2.2.7 RNA的金粉包裹
        2.2.8 基因槍轟擊
        2.2.9 馬鈴薯葉片基因槍轉(zhuǎn)化
        2.2.10 馬鈴薯葉片愈傷的基因槍轉(zhuǎn)化
        2.2.11 馬鈴薯葉片DNA的提取
        2.2.12 建立PCR產(chǎn)物混合池
        2.2.13 馬鈴薯試管苗的培養(yǎng)
三 結(jié)果
    3.1 CRISPR敲除載體構(gòu)建
        3.1.1 載體構(gòu)建
        3.1.2 RNA體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果
    3.2 愈傷組織的培養(yǎng)
    3.3 基因槍預(yù)實(shí)驗(yàn)
        3.3.1 馬鈴薯莖段愈傷組織基因槍轟擊預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.2 馬鈴薯葉片愈傷組織基因槍預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.3 馬鈴薯葉片組織的基因槍預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.4 基因槍實(shí)驗(yàn)
        3.4.1 馬鈴薯葉片愈傷組織基因槍實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.2 馬鈴薯葉片基因槍實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果
四 討論
    4.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的改進(jìn)與優(yōu)化
    4.2 基因槍轟擊技術(shù)的改進(jìn)與優(yōu)化
五 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 實(shí)驗(yàn)方法
    附錄2 Barcode引物
    附錄3 培養(yǎng)基配制方法
    附錄4 公司合成序列
    附錄5 DNA提取及PCR產(chǎn)物結(jié)果圖
    附錄6 深度測(cè)序結(jié)果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[8]龍葵素在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用[J]. 李紅梅,謝麥香.  山西農(nóng)業(yè). 2005(08)

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)選育馬鈴薯低龍葵素、抗低溫糖化和支鏈淀粉高的新品系[D]. 趙國(guó)超.內(nèi)蒙古大學(xué) 2019
[2]應(yīng)用基因編輯技術(shù)抑制馬鈴薯多酚氧化酶的研究[D]. 陳明俊.貴州大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3708335