生物粘合劑具有良好的生物相容性和可降解性,可以替代傳統(tǒng)的縫合技術,在生物醫(yī)藥領域已被受到廣泛關注。新月柄桿菌（Caulobacter crescentus CB15）能分泌迄今為止粘附能力最強的水下天然粘性物質(zhì)-holdfast,其合成和分泌途徑是一個復雜的過程,其中hfsH基因編碼的多糖脫乙�；甘怯绊懻承缘年P鍵因素。因此,本論文以新月柄桿菌hfsH基因為研究對象,對其密碼子進行優(yōu)化及生物信息學分析,并進行了克隆和可溶性表達,在利用鎳柱親和層析分析純化重組酶的基礎上,對其生物學活性進行了初步評價。主要研究內(nèi)容有以下幾部分:第一部分:新月柄桿菌hfsH基因分析及載體構建。對hfsH基因的原始序列進行密碼子優(yōu)化,并利用RNAfold在線軟件對優(yōu)化前后hfsH基因序列的5′和3′端mRNA二級結構的自由能及GC含量進行分析。結果發(fā)現(xiàn),優(yōu)化后的序列自由能降低,GC含量從71%降至67%,更利于后期表達。生物信息學分析表明,有5個相對保守的氨基酸功能域分別是Motif 1（T（F/Y）DD）、Motif 2（H（S/T）xxH）、Motif 3（RxPY）、Motif 4(DxxD（W/Y）及... 

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
術語與縮略語表
第一章 緒論
    1.1 生物粘合劑
    1.2 源于新月柄桿菌的超高粘附物質(zhì)holdfast概述
        1.2.1 新月柄桿菌
        1.2.2 新月柄桿菌分泌物-holdfast
        1.2.3 Holdfast的化學結構
        1.2.4 Holdfast的生物合成
    1.3 多糖脫乙�；傅难芯楷F(xiàn)狀
        1.3.1 多糖脫乙�；父攀�
        1.3.2 來源與分類
        1.3.3 多糖脫乙�；傅慕Y構特點
        1.3.4 多糖脫乙�；傅牡孜镱愋图疤卣�
        1.3.5 多糖脫乙酰化酶的催化機制
        1.3.6 多糖脫乙�；傅膽们熬�
    1.4 研究目的及意義
第二章 新月柄桿菌多糖脫乙�；富虻纳镄畔W分析及載體構建
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌種與載體
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 標準溶液的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 新月柄桿菌hfsH基因功能的生物信息學分析
        2.2.2 新柄桿菌hfsH基因的序列優(yōu)化
        2.2.3 新月柄桿菌hfsH基因克隆
        2.2.4 PCR產(chǎn)物的回收
        2.2.5 pET-28a(+)-hfsH重組表達載體構建流程
        2.2.6 PCR回收產(chǎn)物和pET-28a(+)載體的雙酶切
        2.2.7 連接
        2.2.8 轉化
        2.2.9 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒提取
        2.2.10 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒酶切鑒定
        2.2.11 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒測序及菌種保藏
    2.3 實驗結果與分析
        2.3.1 生物信息學分析
        2.3.2 hfsH基因序列的優(yōu)化及分析
        2.3.3 PCR擴增產(chǎn)物及分析
        2.3.4 酶切電泳檢測結果及分析
        2.3.5 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒酶切鑒定結果及分析
        2.3.6 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒序列測定結果及分析
    2.4 討論
第三章 新月柄桿菌多糖脫乙�；富虻谋磉_及重組蛋白純化
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌種和質(zhì)粒
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 實驗儀器
        3.1.4 標準溶液的配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 新月柄桿菌hfsH基因誘導表達
        3.2.2 SDS-PAGE凝膠電泳檢測
        3.2.3 誘導表達條件的優(yōu)化
        3.2.4 重組HfsH蛋白純化
        3.2.5 蛋白濃度的測定
        3.2.6 N端測序鑒定
    3.3 實驗結果與分析
        3.3.1 大腸桿菌生長曲線
        3.3.2 hfsH基因表達及條件優(yōu)化結果
        3.3.3 重組HfsH蛋白的純化結果
        3.3.4 重組HfsH蛋白N端測序鑒定
        3.3.5 重組HfsH蛋白濃度的測定
    3.4 討論
第四章 新月柄桿菌多糖脫乙�；傅幕钚苑治�
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗試劑
        4.1.2 實驗儀器
        4.1.3 標準溶液的配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 酶活方法的建立
        4.2.2 重組HfsH最適溫度的測定
        4.2.3 重組HfsH最適pH的測定
    4.3 實驗結果及分析
        4.3.1 標準曲線繪制
        4.3.2 活性測定結果
        4.3.3 酶濃度對酶活性的影響
        4.3.4 最適反應溫度及分析
        4.3.5 最適反應pH及分析
    4.4 討論
第五章 全文結論
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間取得的科研成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]重組Trail蛋白在大腸桿菌中的表達及純化條件的優(yōu)化[J]. 蔡媛媛,李雪燕,吳玉,杜晶春,徐霞.  細胞與分子免疫學雜志. 2012(06)
[2]塞內(nèi)昔布抑制兔脈絡膜新生血管的形成[J]. 喬崗,周希瑗,鄧鑫,李琳.  眼視光學雜志. 2005(04)



本文編號：3707354