生物粘合劑具有良好的生物相容性和可降解性,可以替代傳統(tǒng)的縫合技術(shù),在生物醫(yī)藥領(lǐng)域已被受到廣泛關(guān)注。新月柄桿菌（Caulobacter crescentus CB15）能分泌迄今為止粘附能力最強(qiáng)的水下天然粘性物質(zhì)-holdfast,其合成和分泌途徑是一個(gè)復(fù)雜的過程,其中hfsH基因編碼的多糖脫乙�；甘怯绊懻承缘年P(guān)鍵因素。因此,本論文以新月柄桿菌hfsH基因?yàn)檠芯繉?duì)象,對(duì)其密碼子進(jìn)行優(yōu)化及生物信息學(xué)分析,并進(jìn)行了克隆和可溶性表達(dá),在利用鎳柱親和層析分析純化重組酶的基礎(chǔ)上,對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。主要研究?jī)?nèi)容有以下幾部分:第一部分:新月柄桿菌hfsH基因分析及載體構(gòu)建。對(duì)hfsH基因的原始序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并利用RNAfold在線軟件對(duì)優(yōu)化前后hfsH基因序列的5′和3′端mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能及GC含量進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),優(yōu)化后的序列自由能降低,GC含量從71%降至67%,更利于后期表達(dá)。生物信息學(xué)分析表明,有5個(gè)相對(duì)保守的氨基酸功能域分別是Motif 1（T（F/Y）DD）、Motif 2（H（S/T）xxH）、Motif 3（RxPY）、Motif 4(DxxD（W/Y）及... 

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
術(shù)語(yǔ)與縮略語(yǔ)表
第一章 緒論
    1.1 生物粘合劑
    1.2 源于新月柄桿菌的超高粘附物質(zhì)holdfast概述
        1.2.1 新月柄桿菌
        1.2.2 新月柄桿菌分泌物-holdfast
        1.2.3 Holdfast的化學(xué)結(jié)構(gòu)
        1.2.4 Holdfast的生物合成
    1.3 多糖脫乙酰化酶的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 多糖脫乙�；父攀�
        1.3.2 來源與分類
        1.3.3 多糖脫乙�；傅慕Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.3.4 多糖脫乙�；傅牡孜镱愋图疤卣�
        1.3.5 多糖脫乙酰化酶的催化機(jī)制
        1.3.6 多糖脫乙�；傅膽�(yīng)用前景
    1.4 研究目的及意義
第二章 新月柄桿菌多糖脫乙�；富虻纳镄畔W(xué)分析及載體構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌種與載體
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 新月柄桿菌hfsH基因功能的生物信息學(xué)分析
        2.2.2 新柄桿菌hfsH基因的序列優(yōu)化
        2.2.3 新月柄桿菌hfsH基因克隆
        2.2.4 PCR產(chǎn)物的回收
        2.2.5 pET-28a(+)-hfsH重組表達(dá)載體構(gòu)建流程
        2.2.6 PCR回收產(chǎn)物和pET-28a(+)載體的雙酶切
        2.2.7 連接
        2.2.8 轉(zhuǎn)化
        2.2.9 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒提取
        2.2.10 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒酶切鑒定
        2.2.11 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒測(cè)序及菌種保藏
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 生物信息學(xué)分析
        2.3.2 hfsH基因序列的優(yōu)化及分析
        2.3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及分析
        2.3.4 酶切電泳檢測(cè)結(jié)果及分析
        2.3.5 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果及分析
        2.3.6 pET-28a(+)-hfsH重組質(zhì)粒序列測(cè)定結(jié)果及分析
    2.4 討論
第三章 新月柄桿菌多糖脫乙酰化酶基因的表達(dá)及重組蛋白純化
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種和質(zhì)粒
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 新月柄桿菌hfsH基因誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.2 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)
        3.2.3 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
        3.2.4 重組HfsH蛋白純化
        3.2.5 蛋白濃度的測(cè)定
        3.2.6 N端測(cè)序鑒定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線
        3.3.2 hfsH基因表達(dá)及條件優(yōu)化結(jié)果
        3.3.3 重組HfsH蛋白的純化結(jié)果
        3.3.4 重組HfsH蛋白N端測(cè)序鑒定
        3.3.5 重組HfsH蛋白濃度的測(cè)定
    3.4 討論
第四章 新月柄桿菌多糖脫乙�；傅幕钚苑治�
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 酶活方法的建立
        4.2.2 重組HfsH最適溫度的測(cè)定
        4.2.3 重組HfsH最適pH的測(cè)定
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
        4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
        4.3.2 活性測(cè)定結(jié)果
        4.3.3 酶濃度對(duì)酶活性的影響
        4.3.4 最適反應(yīng)溫度及分析
        4.3.5 最適反應(yīng)pH及分析
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間取得的科研成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]重組Trail蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化條件的優(yōu)化[J]. 蔡媛媛,李雪燕,吳玉,杜晶春,徐霞.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2012(06)
[2]塞內(nèi)昔布抑制兔脈絡(luò)膜新生血管的形成[J]. 喬崗,周希瑗,鄧鑫,李琳.  眼視光學(xué)雜志. 2005(04)



本文編號(hào)：3707354