無(wú)脊椎動(dòng)物沒有獲得性免疫,只有先天性免疫,而先天性免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫,抗菌肽和proPO激活系統(tǒng)則是體液免疫的兩種重要組成成分,在昆蟲的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本文主要研究了wap抗菌肽和proPO激活系統(tǒng),對(duì)抗菌肽在真核生物體內(nèi)的功能以及體外表達(dá)進(jìn)行了研究,對(duì)proPO激活系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了定位與分類,并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了初步的探索。本文利用果蠅這一遺傳背景清晰的真核生物,將外源wap基因?qū)牍夡w內(nèi),構(gòu)建了VAS-wap轉(zhuǎn)基因果蠅品系。并利用遺傳變異法對(duì)wap在UAS-wap轉(zhuǎn)基因果蠅品系中的染色體位置進(jìn)行了基因定位,得到了wap分別插入在轉(zhuǎn)基因果蠅性染色體、第二染色體、第三染色體基因型的品系,將它們與actin-Ga14果蠅雜交,實(shí)現(xiàn)了wap基因在它們雜交后代果蠅中的過表達(dá),通過QPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),wap基因在mRNA水平的表達(dá)量明顯高于對(duì)照,有的達(dá)100多倍。并對(duì)wap抗菌肽在轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)的抗菌功能進(jìn)行了探究與驗(yàn)證,并獲得了明確的抗菌效果。該結(jié)果為新型抗菌藥物的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。隨著大家對(duì)抗菌肽的重視程度越來(lái)越高,已經(jīng)有人用原核表達(dá)系統(tǒng)在體外成功的獲得了WAP重... 

【文章來(lái)源】：濟(jì)南大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：88 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
導(dǎo)師簡(jiǎn)介
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1.1 WAP抗菌肽簡(jiǎn)介
    1.2 WAP抗菌肽的研究意義
第二章 wap在轉(zhuǎn)基因果蠅的染色體定位和表達(dá)水平分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 果蠅飼養(yǎng)
        2.2.2 遺傳雜交法定位wap基因在轉(zhuǎn)基因果蠅染色體的插入位點(diǎn)
        2.2.4 wap在轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)的表達(dá)水平分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 wap在轉(zhuǎn)基因果蠅染色體定位的結(jié)果
        2.3.2 qRT-PCR分析wap在轉(zhuǎn)基因果蠅體內(nèi)RNA水平表達(dá)結(jié)果
    2.4 結(jié)論
第三章 WAP抗菌肽在果蠅體內(nèi)的抗菌功能
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器試劑
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 菌液的制備
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)組果蠅與對(duì)照組果蠅的制備
        3.2.3 果蠅存活與死亡情況的觀察比較
    3.3 結(jié)果與分析
    3.4 結(jié)論
第四章 WAP抗菌肽在真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器試劑
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)溶液配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 wap/pPIC9K表達(dá)載體的構(gòu)建
            4.2.1.1 WAP抗菌肽基因的釣取與擴(kuò)增
            4.2.1.2 wap/pPIC9K表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.2 酵母的轉(zhuǎn)化
            4.2.2.1 KM71畢赤酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
            4.2.2.2 轉(zhuǎn)化
        4.2.3 WAP的誘導(dǎo)表達(dá)
            4.2.3.1 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選
            4.2.3.2 誘導(dǎo)表迭
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 wap/pPICPK重組載體構(gòu)建
        4.3.2 SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果
    4.4 結(jié)論
第五章 WAP抗菌肽在原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)與功能分析
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 WAP抗菌肽基因的釣取與擴(kuò)增
        5.2.2 WAP重組載體的構(gòu)建與篩選
            5.2.2.1 酶切
            5.2.2.2 連接
            5.2.2.3 轉(zhuǎn)化
            5.2.2.4 篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,提取重組質(zhì)粒
            5.2.2.5 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證
        5.2.3 WAP體外表達(dá)菌株的構(gòu)建與篩選
        5.2.4 試表達(dá)篩選最優(yōu)表達(dá)條件
            5.2.4.1 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的摸索
            5.2.4.2 誘導(dǎo)劑濃度的摸索
            5.2.4.3 誘導(dǎo)表達(dá)溫度的摸索
        5.2.5 WAP重組蛋白的分離純化
        5.2.7 WAP抗菌肽重組蛋白的活性與功能檢測(cè)
            5.2.7.1 WAP抗菌肽體外抑蛋白酶活性檢測(cè)
            5.2.7.2 WAP抗菌肽體外抑菌活性檢測(cè)
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 WAP抗菌肽基因的PCR釣取與擴(kuò)增結(jié)果
        5.3.2 WAP重組載體的構(gòu)建與篩選結(jié)果
        5.3.3 WAP體外表達(dá)菌株的構(gòu)建與篩選結(jié)果
        5.3.4 體外誘導(dǎo)最優(yōu)條件的確定
        5.3.5 WAP重組蛋白純化回收的結(jié)果
        5.3.6 WAP重組蛋白抑蛋白酶活性的測(cè)定結(jié)果
    5.4 結(jié)論
附：第一章 家蠅proPO系統(tǒng)簡(jiǎn)介
附：第二章 家蠅proPO系統(tǒng)關(guān)鍵基因的鑒定與表達(dá)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備
        2.1.1 家蠅與菌種
        2.1.2 試劑與儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 家蠅proPO系統(tǒng)關(guān)鍵基因的鑒定
            2.2.1.1 家蠅轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
            2.2.1.2 轉(zhuǎn)錄組序列篩選
            2.2.1.3 序列拼接
            2.2.1.4 序列分析
            2.2.1.5 基因鑒定與分類
            2.2.1.6 測(cè)序驗(yàn)證
        2.2.2 家蠅proPO系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達(dá)模式分析
            2.2.2.1 提取家蠅幼蟲的RNA
            2.2.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA
            2.2.2.3 qRT-PCR
        2.2.3 家蠅mdPAP1的克隆與蛋白重組表達(dá)
            2.2.3.1 mdPAP1基因ORF框的克隆
            2.2.3.2 mdPAP1重組載體的構(gòu)建
            2.2.3.3 mdPAPP1表達(dá)菌株的構(gòu)建與篩選
        2.2.4 家蠅酚氧化酶原激活酶的體內(nèi)RNAi實(shí)驗(yàn)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 家蠅Serpin基因的鑒定與分類結(jié)果
        2.3.2 家蠅proPO系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達(dá)模式分析
        2.3.3 家蠅mdPAP1的克隆與蛋白重組表達(dá)
        2.3.4 家蠅mdPAP1的體內(nèi)RNAi實(shí)驗(yàn)
    2.4 結(jié)論
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3591924