豬流行性腹瀉（PED）是以水樣腹瀉、脫水和嘔吐為臨床癥狀的一種高接觸性急性腸道傳染病,病原為豬流行性腹瀉病毒（PEDV）.豬流行性腹瀉病毒和傳染性胃腸炎病毒（TGEV）同屬冠狀病毒科（coronaviridae）冠狀病毒屬（coronavirus）的成員。PEDV可以誘使各種年齡段的豬發(fā)病,其中受它侵害最嚴(yán)重的是哺乳仔豬,可造成乳豬高達(dá)100%的發(fā)病率和死亡率。自2011年在我國(guó)暴發(fā)以來(lái),該病已然成為世界流行性的疾病,是造成我國(guó)各地養(yǎng)殖場(chǎng)仔豬死亡的主要疫病之一,嚴(yán)重地危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)利益。因此,每年對(duì)PED的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和免疫預(yù)防是一項(xiàng)必不可少的任務(wù),特別是通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)PEDV的分子流行病學(xué)特征進(jìn)行監(jiān)測(cè),可使我們了解PEDV毒株的來(lái)源和變異程度及毒株之間的親緣關(guān)系,從而為該病的防控提供理論依據(jù)。針對(duì)于此,本論文進(jìn)行了如下內(nèi)容的研究：（1）利用RT-PCR和分子克隆等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)地方流行毒株SDZB_CH2014進(jìn)行了全基因測(cè)序,并使用CLUSTAL1.83和MAGE5軟件將該序列與來(lái)自我國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、加拿大等國(guó)的64株參考毒株進(jìn)行比較分析... 

【文章來(lái)源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 綜述
    1 PED的流行
        1.1 國(guó)外流行情況
        1.2 國(guó)內(nèi)流行情況
    2 PEDV的形態(tài)結(jié)構(gòu)
    3 PEDV的分類地位和分子特征
    4 PED的診斷
        4.1 RT-PCR法
        4.2 ELISA法
        4.3 免疫電鏡法
        4.4 直接免疫熒光法
        4.5 微量血清中和試驗(yàn)
    5 PED的治療
    6 PED的疫苗研究
        6.1 PED組織滅活苗
        6.2 PED細(xì)胞滅活苗
        6.3 PED弱毒苗
        6.4 轉(zhuǎn)基因疫苗
            6.4.1 植物疫苗
            6.4.2 乳酸桿菌疫苗
    7 選題的目的及意義
第二章 一株P(guān)EDV流行毒株全基因組的序列分析
    1 材料與方法
        1.1 樣品
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 引物設(shè)計(jì)
        1.5 總RNA提取
        1.6 獲得目的片段的方法
        1.7 PEDV全基因的分析
        1.8 參考序列
        1.9 RT-PCR
            1.9.1 RT-PCR擴(kuò)增體系
            1.9.2 RT-PCR擴(kuò)增程序
        1.10 PCR產(chǎn)物鑒定及純化回收
            1.10.1 PCR產(chǎn)物鑒定
            1.10.2 PCR產(chǎn)物的回收
        1.11 PCR產(chǎn)物連接與轉(zhuǎn)化
            1.11.1 連接
            1.11.2 轉(zhuǎn)化
        1.12 重組質(zhì)粒提取、鑒定及序列測(cè)定
            1.12.1 篩選菌落
            1.12.2 堿裂解法提取質(zhì)粒
            1.12.3 重組質(zhì)粒的鑒定
            1.12.4 序列測(cè)定
    2 結(jié)果
        2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
        2.2 PEDV流行毒株SDZB_CH2014與64株參考毒株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系
        2.3 S基因分析
            2.3.1 S基因抗原性分析
            2.3.2 S基因的B細(xì)胞線性表位分析
            2.3.3 S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
        2.4 ORF3系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)
        2.5 E基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)
        2.6 M基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)
        2.7 N基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)
    3 討論
第三章 2013-2014年P(guān)EDV地方流行毒株S基因的分析
    1 材料與方法
        1.1 樣品
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 引物設(shè)計(jì)
        1.5 總RNA提取
        1.6 獲得目的片段的方法
        1.7 S 基因的分析
        1.8 參考序列
        1.9 PEDV S基因RT-PCR
            1.9.1 RT-PCR擴(kuò)增體系
            1.9.2 RT-PCR擴(kuò)增程序
        1.10 PCR產(chǎn)物鑒定及純化回收
        1.11 PCR產(chǎn)物連接與轉(zhuǎn)化
        1.12 重組質(zhì)粒提取、鑒定及序列測(cè)定
    2. 結(jié)果與分析
        2.1 S基因的RT-CR
        2.2 PEDV流行毒株S基因與參考毒株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)
            2.2.1. 序列確定
            2.2.2 PEDV S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
            2.2.3 PEDV S基因與8株參考毒株同源性分析
    3 討論
第四章 PEDV流行毒株和疫苗株S基因抗原表位表達(dá)
    1 材料和方法
        1.1 病毒、細(xì)胞、載體、感受態(tài)細(xì)胞
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 融合試劑盒的選擇
        1.5 引物的設(shè)計(jì)
        1.6 大腸桿菌原核表達(dá)載體和限制性內(nèi)切酶的選擇
        1.7 目的片段擴(kuò)增引物和融合片段(S1P1-3)的鑒定引物
        1.8 目的片段擴(kuò)增
        1.9 目的片段的融合和轉(zhuǎn)化
            1.9.1 PCR產(chǎn)物電泳、回收
            1.9.2 目的片段的融合
            1.9.3 融合片段的轉(zhuǎn)化
        1.10 重組質(zhì)粒提取和鑒定
            1.10.1 篩選菌落
            1.10.2 堿裂解法提取質(zhì)粒
            1.10.3 重組質(zhì)粒的鑒定
        1.11 大腸桿菌原核表達(dá)載體pET32a(+)和含有融合片段的重組質(zhì)粒PMD18-T的酶切、回收
            1.11.1 酶切
            1.11.2 回收
        1.12 表達(dá)載體pET32a(+)與融合片段S1P1-3的連接
        1.13 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞
        1.14 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌BL21
        1.15 鑒定
        1.16 表達(dá)
            1.16.1 時(shí)間優(yōu)化
            1.16.2 IPTG濃度優(yōu)化
        1.17 SDS-PAGE
        1.18 Western BLot
            1.18.1 電泳分離
            1.18.2 轉(zhuǎn)膜
            1.18.3 雜交與顯色
    2 結(jié)果和分析
        2.1 S1基因3個(gè)片段的PCR擴(kuò)增
        2.2 載體和融合片段的酶切
        2.3 重組質(zhì)粒PCR鑒定
        2.4 SDS-PAGE
        2.5 Western-Blotting檢測(cè)
    3 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士期間的主要科研成果
項(xiàng)目資助
致謝
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]新發(fā)豬流行性腹瀉病毒ORF3基因的遺傳進(jìn)化分析[J]. 董世娟,朱于敏,于瑞嵩,司伏生,石明明,張?jiān)词?李震.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(05)
[2]仔豬流行性腹瀉的新特點(diǎn)與防控建議[J]. 楊漢春.  北方牧業(yè). 2013(13)
[3]2011年福建省豬流行性腹瀉的流行特點(diǎn)及其防治措施[J]. 張世忠,江斌.  福建畜牧獸醫(yī). 2012(02)
[4]豬流行性腹瀉的防治[J]. 廖啟富.  湖北畜牧獸醫(yī). 2012(03)
[5]國(guó)內(nèi)豬流行性腹瀉防治概況[J]. 徐國(guó)棟,李峰,張廣峰.  畜牧與獸醫(yī). 2011(12)
[6]豬流行性腹瀉的特點(diǎn)與防控[J]. 李中興,毛雪紅.  農(nóng)村養(yǎng)殖技術(shù). 2011(23)
[7]豬流行性腹瀉流行特點(diǎn)及流行現(xiàn)狀的研究[J]. 甘振磊,湯德元,李春燕,王彬,張曉杰,王鳳,劉志杰.  豬業(yè)科學(xué). 2010(12)
[8]豬流行性腹瀉的實(shí)驗(yàn)室診斷方法[J]. 李思銀,楊亮宇,楊玉艾.  豬業(yè)科學(xué). 2010(12)
[9]豬流行性腹瀉的實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展[J]. 劉濤,王瑞.  豬業(yè)科學(xué). 2010(12)
[10]表達(dá)豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點(diǎn)的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經(jīng).  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2010(07)



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