發(fā)布時(shí)間：2017-05-11 12:18

  本文關(guān)鍵詞：基于噻唑橙和聚苯胺的DNA甲基化檢測(cè)方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式,在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,將甲基自由基選擇性地添加到DNA的CpG序列的胞嘧啶上,從而形成5-甲基胞嘧啶,通常發(fā)生在基因的5'-CG-3'序列(被稱(chēng)為CpG島)。大量的科學(xué)研究表明,DNA甲基化涉及到很多細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程,例如調(diào)控基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、抑制轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X-染色體失活、染色體結(jié)構(gòu)重組、基因組印跡和染色體的穩(wěn)定性。在高等真核生物的正常細(xì)胞中,一般情況下CpG島是末甲基化,但是,異常甲基化會(huì)抑制遺傳信息的表達(dá),會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)各種疾病,比如癌癥的發(fā)生。因此,DNA甲基化可以作為疾病的一種潛在生物標(biāo)志。同時(shí),甲基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞分化和發(fā)育、基因的抑制、腫瘤和基因疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,所以甲基轉(zhuǎn)移酶的活性評(píng)價(jià)在藥物研發(fā)和臨床診斷的領(lǐng)域很重要。因此,發(fā)展一種迅速、簡(jiǎn)單、高效、選擇性高的DNA甲基化和甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)方法是刻不容緩的。本論文圍繞DNA甲基化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)開(kāi)展了如下兩個(gè)工作：第一,我們發(fā)展了一種基于限制性?xún)?nèi)切酶HpaⅡ和外切酶III(Exo III)的無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)DNA甲基化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法。設(shè)計(jì)了一種可與目標(biāo)DNA雜交形成雙鏈DNA的無(wú)標(biāo)記探針DNA。我們以從人p53基因外顯子8上截取了一段32堿基長(zhǎng)度的DNA作為研究對(duì)象。由于HpaⅡ切割和ExoⅢ消化的作用,雙鏈DNA會(huì)變成單鏈DNA,導(dǎo)致噻唑橙的熒光強(qiáng)度減弱。但是,在雙鏈DNA上特定的序列被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化后,就會(huì)抑制Jpan和Exo Ⅲ的功能,噻唑橙嵌入到雙鏈DNA中,從而發(fā)出很強(qiáng)的熒光。這種方法可以確定DNA上特定位點(diǎn)CpG的甲基化,同時(shí)我們進(jìn)一步考察了由化學(xué)試劑二甲亞砜(DMSO)和乙醛(CH3CH0)引起的甲基化。對(duì)人血清樣品的分析,表明此方法在進(jìn)一步應(yīng)用到復(fù)雜的生物胖品中有著巨大的潛力。第二,發(fā)展了一種基于限制性?xún)?nèi)切酶HpaⅡ和HRP模擬酶(bemin/G-quadruplex DNAzyme)誘導(dǎo)聚苯胺合成的甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)方法。其中HRP模擬酶作為一種強(qiáng)催化劑,催化雙氧水誘導(dǎo)苯胺在電極表面的DNA上聚合生成聚苯胺(PANI),進(jìn)而聚苯胺作為本實(shí)驗(yàn)中的氧化還原信號(hào)分子。電極表面先修飾捕獲探針(S1),然后與目標(biāo)DNA (S2)雜交形成雙鏈DNA。在沒(méi)有甲基轉(zhuǎn)移酶存在的情況下,雙鏈DNA就會(huì)被HpaⅡⅡ切割,那么DANzyme DNA (S3)就不能與電極上的DNA雜交,繼而HRP模擬酶也就不會(huì)形成。苯胺不能在電極表面聚合,就不會(huì)有電流信號(hào)。但是,在甲基轉(zhuǎn)移酶存在的情況下,雙鏈DNA會(huì)被甲基化,就會(huì)抑制HpaⅡ的切割功能。HRP模擬酶順利在電極表面形成,催化H2O2誘導(dǎo)苯胺聚合。由于聚苯胺的生成,就會(huì)有強(qiáng)的電流信號(hào)。這種方法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)特定位點(diǎn)CpG的甲基化。同時(shí)也對(duì)人血清中檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的效果進(jìn)行了驗(yàn)證。另外,我們還研究這種方法在甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑篩選中的應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：DNA甲基化 甲基轉(zhuǎn)移酶 限制性?xún)?nèi)切酶 噻唑橙 聚苯胺 熒光檢測(cè) 電化學(xué)檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 緒論9-18
• 1.1 DNA甲基化概述9-11
• 1.1.1 CpG島9-10
• 1.1.2 DNA甲基化的生成10
• 1.1.3 DNA甲基化與腫瘤10-11
• 1.2 影響DNA甲基化的因素11-14
• 1.2.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶11-12
• 1.2.2 組蛋白甲基化12
• 1.2.3 飲食等環(huán)境因素12-13
• 1.2.4 RNA干擾13-14
• 1.2.5 病毒感染14
• 1.3 DNA甲基化的檢測(cè)方法14-17
• 1.3.1 重亞硫酸鹽測(cè)序法14-15
• 1.3.2 高效液相色譜15
• 1.3.3 高效毛細(xì)管電泳法15
• 1.3.4 甲基化敏感性限制內(nèi)切酶法15-16
• 1.3.5 甲基化結(jié)合蛋白分析方法16-17
• 1.4 本文研究的內(nèi)容17-18
• 第二章 基于限制性?xún)?nèi)切酶和外切酶Ⅲ的無(wú)標(biāo)記熒光檢測(cè)DNA甲基化和甲基轉(zhuǎn)移酶活性18-29
• 2.1 引言18-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分20-21
• 2.2.1 試劑和儀器20
• 2.2.2 探針DNA與目標(biāo)DNA雜交20
• 2.2.3 DNA甲基化及限制性?xún)?nèi)切酶和外切酶Ⅲ的作用20-21
• 2.2.4 由化學(xué)試劑引起的DNA甲基化21
• 2.2.5 在血清中檢測(cè)M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性21
• 2.3 結(jié)果與討論21-28
• 2.3.1 噻唑橙的熒光性能和它的濃度優(yōu)化21-22
• 2.3.2 HpaⅡ和ExoⅢ的功能驗(yàn)證及它們的濃度優(yōu)化22-23
• 2.3.3 目標(biāo)DNA檢測(cè)及驗(yàn)證其選擇性23-25
• 2.3.4 DNA甲基化及甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測(cè)25-26
• 2.3.5 化學(xué)試劑甲基化的檢測(cè)26-27
• 2.3.6 在人血清中檢測(cè)M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶的活性27-28
• 2.4 本章小結(jié)28-29
• 第三章 基于限制性?xún)?nèi)切酶HpaⅡ和聚苯胺的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性29-41
• 3.1 引言29-31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分31-33
• 3.2.1 試劑和儀器31
• 3.2.2 捕獲探針DNA修飾金電極的制備31-32
• 3.2.3 捕獲DNA與目標(biāo)DNA雜交32
• 3.2.4 DNA甲基化及限制性?xún)?nèi)切酶HpaⅡ和外切酶Ⅲ的作用32
• 3.2.5 HRP模擬酶和聚苯胺的形成32
• 3.2.6 抑制劑對(duì)M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制32-33
• 3.2.7 電化學(xué)測(cè)試33
• 3.3 結(jié)果與討論33-40
• 3.3.1 聚苯胺的電化學(xué)性能33-35
• 3.3.2 電化學(xué)檢測(cè)M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性35-38
• 3.3.3 在人血清中測(cè)定M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶的活性38-39
• 3.3.4 不同濃度抑制劑對(duì)M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制39-40
• 3.4 本章小結(jié)40-41
• 第四章 總結(jié)與展望41-42
• 參考文獻(xiàn)42-52
• 致謝52-53
• 作者簡(jiǎn)介53

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 徐耀忠;Thiobase DNA: the chemistry and some applications in cancer studies[J];Progress in Natural Science;2000年06期

2 傅衍 ,牛冬 ,阮暉 ,陳海燕;COMPARISON OF DIFFERENT ENZYMES AND PROBES AND THEIR COMBINATIONS IN DNA FINGERPRINTING[J];Journal of Zhejiang University Science;2001年04期

3 安小惠 ,王一理 ,來(lái)寶長(zhǎng) ,耿一萍 ,司履生;CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS[J];Journal of Xi'an Medical University;2001年02期

4 張鵬 ,孟繼本 ,龍江 ,松浦輝男 ,王永梅;Synthesis of Benzo [α]phenoxazin-5-one Derivatives and Their Interactions with DNA[J];Chinese Journal of Chemistry;2002年05期

5 ;DIFFERENT RESULTS BY DIFFERENT COMMERCIAL TAQ DNA POLYMERASE IN RAPD[J];四川動(dòng)物;2002年02期

6 ;Genetic Diversity of Three Aristichthys nobilis Populations and One Inbreeding Stock[J];Wuhan University Journal of Natural Sciences;2002年02期

7 強(qiáng)曉藝;DNA計(jì)算的應(yīng)用與展望[J];西安聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào);2002年02期

8 王軍陽(yáng),范桂香,勝利,袁育康;THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2002年02期

9 董菁 ,成軍 ,王勤環(huán) ,施雙雙 ,王剛 ,斯崇文;CLONING AND ANALYSIS OF THE GENOMIC DNA SEQUENCE OF AUGMENTER OF LIVERR EGENERATION FROM RAT[J];Chinese Medical Sciences Journal;2002年02期

10 謝傳曉;Evidence for Base Substitutions and Repair of DNA Mismatch Damage Induced by Low Energy N~+ Ion Beam Implantation in E. coli[J];High Technology Letters;2003年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 Michael J.Siefkes;Cory O.Brant;Ronald B.Walter;;A novel real-time XL-PCR for DNA damage detection[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2011年

2 ;Hormonal Regulation and Tumorigenic Role of DNA Methyltransferase[A];2011中國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省計(jì)劃生育與生殖醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨生殖健康講習(xí)班論文匯編[C];2011年

3 Dongmei Zhao;Fan Jin;Yuli Qian;Hefeng Huang;;Expression patterns of Dnmtl and Dnmt3b in preimplantational mouse embryos and effects of in-vitro cultures on their expression[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議婦科內(nèi)分泌會(huì)場(chǎng)（婦科內(nèi)分泌學(xué)組、絕經(jīng)學(xué)組、計(jì)劃生育學(xué)組）論文匯編[C];2012年

4 姜東成;蔣稼歡;楊力;蔡紹皙;K.-L.Paul Sung;;在聚吡咯微點(diǎn)致動(dòng)下的DNA雜交行為[A];2008年全國(guó)生物流變學(xué)與生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2008年

5 白明慧;翁小成;周翔;;聯(lián)鄰苯二酚類(lèi)小分子作為DNA交聯(lián)劑的研究[A];第六屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

6 張曄;杜智;楊斌;高英堂;;檢測(cè)外周血中游離DNA的應(yīng)用前景(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)暨首屆生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

7 周紅;鄭江;王良喜;丁國(guó)富;魯永玲;潘文東;羅平;肖光夏;;CpG DNA誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征的作用及其機(jī)制研究[A];全國(guó)燒傷創(chuàng)面處理、感染專(zhuān)題研討會(huì)論文匯編[C];2004年

8 ;EFFECTS OF Ku70-DEFICIENT ON ARSENITE-INDUCED DNA DOUBLE STRAND BREAKS, CHROMOSOMAL ALTERATIONS AND CELL CYCLE ARREST[A];海峽兩岸第三屆毒理學(xué)研討會(huì)論文摘要[C];2005年

9 李經(jīng)建;冀中華;蔡生民;;小溝結(jié)合方式中的DNA媒介電荷轉(zhuǎn)移[A];第十三次全國(guó)電化學(xué)會(huì)議論文摘要集（下集）[C];2005年

10 ;The interaction between Levofloxacine Hydrochloride and DNA mediated by Cu~(2+)[A];湖北省化學(xué)化工學(xué)會(huì)2006年年會(huì)暨循環(huán)經(jīng)濟(jì)專(zhuān)家論壇論文集[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 本報(bào)記者 袁滿(mǎn);平安：把“領(lǐng)先”作為DNA[N];經(jīng)濟(jì)觀察報(bào);2006年

2 舒放;編織一個(gè)DNA納米桶[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

3 閆潔;英兩無(wú)罪公民起訴要求銷(xiāo)毀DNA記錄[N];新華每日電訊;2008年

4 何德功;日本制成診斷魚(yú)病的“DNA書(shū)”[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2004年

5 本報(bào)記者 張巍巍;DNA樣本也能作假[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

6 周斌偉　鄒巍;蘇州警方應(yīng)用DNA技術(shù)一年偵破案件1887起[N];人民公安報(bào);2011年

7 本報(bào)記者 楊天笑;揭秘“神探”DNA[N];蘇州日?qǐng)?bào);2011年

8 第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室教授 李福洋;破除法老DNA的咒語(yǔ)[N];東方早報(bào);2011年

9 常麗君;DNA電路可檢測(cè)導(dǎo)致疾病的基因損傷[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

10 常麗君;效率和質(zhì)量：“DNA制造業(yè)”兩大障礙被攻克[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 唐陽(yáng);基于質(zhì)譜技術(shù)的基因組DNA甲基化及其氧化衍生物分析[D];武漢大學(xué);2014年

2 池晴佳;DNA動(dòng)力學(xué)與彈性性質(zhì)研究[D];重慶大學(xué);2015年

3 胡璐璐;哺乳動(dòng)物DNA去甲基化過(guò)程關(guān)鍵酶TET2的三維結(jié)構(gòu)與P暬蒲芯縖D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 馬寅洲;基于滾環(huán)擴(kuò)增的DNA自組裝技術(shù)的研究[D];南京大學(xué);2014年

5 黃學(xué)鋒;精子DNA碎片的臨床意義：臨床和實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

6 隋江東;APE1促進(jìn)DNA-PKcs介導(dǎo)hnRNPA1磷酸化及其在有絲分裂期端粒保護(hù)中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 劉松柏;結(jié)構(gòu)特異性核酸酶FEN1在DNA復(fù)制及細(xì)胞周期過(guò)程中的功能性研究[D];浙江大學(xué);2015年

8 王璐;哺乳動(dòng)物中親本DNA甲基化的重編程與繼承[D];中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

9 齊文靖;染色質(zhì)改構(gòu)蛋白BRG1在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中的作用及機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2015年

10 龍湍;水稻T-DNA插入突變?nèi)后w側(cè)翼序列的分離分析和OsaTRZ2的克隆與功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 董洪奎;面向可視化納米操作的DNA運(yùn)動(dòng)學(xué)建模及誤差實(shí)時(shí)校正方法[D];沈陽(yáng)理工大學(xué);2014年

2 聞金燕;水溶性羧基和吡啶基咔咯大環(huán)與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

3 江懌雨;水溶性羧酸卟啉及其配合物與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

4 高志森;比較外周游離循環(huán)腫瘤DNA與癌胚抗原監(jiān)測(cè)非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)前后腫瘤負(fù)荷變化的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 丁浩;血漿循環(huán)DNA完整性及多基因甲基化對(duì)肺癌診斷價(jià)值的研究[D];河北大學(xué);2015年

6 王鵬;基于碳點(diǎn)@氧化石墨烯復(fù)合材料DNA生物傳感器的構(gòu)建及用于PML/RARα基因檢測(cè)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

7 李海青;轉(zhuǎn)堿篷和鹽角草總DNA的耐鹽紫花苜蓿的選育[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

8 李婷婷;小鼠DNA模式識(shí)別重要受體的分子結(jié)構(gòu)特征及其功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

9 劉瑞斯;抗癌藥物奧沙利鉑與DNA相互作用的原子力顯微鏡觀察研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 熊忠;芳香二肽與一價(jià)金屬離子間相互作用及DNA切割活性的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：基于噻唑橙和聚苯胺的DNA甲基化檢測(cè)方法研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：357255