發(fā)布時間：2021-12-11 09:13

　　生物鐘是植物細胞內(nèi)部的授時機制,主要包括輸入途徑、核心振蕩器和信號輸出途徑。在外界環(huán)境因子（主要是光照和溫度）的刺激下其內(nèi)部授時機制發(fā)生大約以24h為周期的振蕩態(tài)節(jié)律。該系統(tǒng)在協(xié)調(diào)植物生長發(fā)育、代謝與生理反應(yīng)等方面具有重要意義,賦予了植物對生存環(huán)境的適應(yīng)性。植物生物鐘系統(tǒng)的核心振蕩器通過多層級調(diào)控復(fù)雜的信號反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)來參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及對生物與非生物脅迫的適應(yīng)性。CCA1是人們鑒定到的第一個生物鐘核心振蕩器基因,進一步的實驗結(jié)果證明在過表達CCA1的情況下擬南芥表現(xiàn)出晚花并抑制內(nèi)源CCA1的表達。據(jù)此,擬南芥體內(nèi)生物鐘的第一個反饋調(diào)節(jié)信號通路機制得到證實:在清晨CCA1/LHY對TOC1的表達具有抑制作用,而在夜間TOC1對CCA1/LHY的表達也具有抑制作用,這奠定人們對研究植物生物鐘的轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋系統(tǒng)的基礎(chǔ)。然而,擬南芥藍光受體隱花色素2（Cryptochrome2,CRY2）對于植物生物鐘的調(diào)控的研究尚不明確。LWDs可通過結(jié)合于CCA1啟動子上的方式來調(diào)控CCA1的表達從而促進植物生物鐘的震蕩。因此我們進一步研究了LWDs對CCA1的調(diào)控是否依賴于CRY2。具體研究結(jié)果... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

生物鐘反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)模型

第2章CRY2與LWDs相互作用驗證30（4）分裝上清到1.5mL離心管中，12000rpm離心20min。（5）重復(fù)過程（2）兩次，確保沒有雜質(zhì)。（6）吸出30μL作為Input。（7）Biotion-Beads用1mLNEBwashbuffer洗三次。（7）剩余樣品與Biotion-Beads完全混合，垂直混勻中孵育2h。（8）棄上清后，1mLNEBwashbuffer洗三次。（9）棄上清，保留Beads與Input內(nèi)加入適量的4*Samplebuffer，金屬浴100℃10min，備用。注：Beads相關(guān)清洗均為800g、5min。2.3.9.3WesternBlot具體步驟參照2.3.8.5。2.4結(jié)果與分析2.4.1載體構(gòu)建結(jié)果哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col4)的cDNA作為模板，通過PCR擴增的方法得到LWD1/LWD2基因，電泳結(jié)果如圖2.1（A）；限制性內(nèi)切酶線性化pGADT7載體的具體結(jié)果如圖2.1（B）；鏈接轉(zhuǎn)化后的菌液PCR具體結(jié)果如圖2.1（C）。abc圖2.1pGADT7-LWD1載體的構(gòu)建Fig.2.1ConstructionofpGADT7-LWD1Vector

第2章CRY2與LWDs相互作用驗證312.4.2組氨酸營養(yǎng)缺陷型實驗及液體顯色驗證CYR2與LWD1的互作2.4.2.1組氨酸缺陷實驗驗證構(gòu)建好pGADT7-LWD1后，利用酵母雙雜交試驗方法初步驗證CRY2和LWDs的互作以及該互作是否是否受藍光誘導(dǎo)。本實驗將pGADT7-LWDs與pBridge-CRY2、pGADT7-LWD1與BD-Vector共轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)細胞中，pGADT7-LWD1與BD-Vector作為陰性對照，分別點斑在SD/-Trp-Leu二缺缺素培養(yǎng)基平板上和SD/-Trp-Leu-His三缺缺素培養(yǎng)基平板上。實驗過程中將所有實驗組分為兩份，一份用30μmol·m2·s1的藍光誘導(dǎo)，另一份進行避光處理后放置于相同環(huán)境條件，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱3~4天后觀察拍照。無論哪種組合在SD/-Trp-Leu二缺平板上的都可以正常生長（如圖2.2所示），證明酵母轉(zhuǎn)化步驟正常；而SD/-Trp-Leu-His三缺缺素培養(yǎng)基平板上可以觀察到僅有放在藍光下的pGADT7-LWD1與pBridge-CRY2、pGADT7-LWD2與pBridge-CRY2這兩組組合正常生長，陰性對照不生長或生長非常弱，說明了CRY2和LWDs可以在酵母細胞內(nèi)互作，并且他們的互作依賴藍光。同時我們發(fā)現(xiàn)LWD2生長情況要比LWD1更好，這有可能是LWD2和CRY2在藍光下互作更強導(dǎo)致。圖2.2組氨酸營養(yǎng)缺陷型實驗展示LWDs和CRY2的互作Fig.2.2HistidineauxotrophicexperimentdemonstratesinteractionofLWDsandCRY2

【參考文獻】：
期刊論文
[1]植物生物鐘研究的歷史回顧與最新進展[J]. 徐小冬,謝啟光.  自然雜志. 2013(02)



本文編號：3534408