利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究OTUD5基因在三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖過程中的作用
發(fā)布時間：2021-11-16 17:01
研究背景及研究目的:隨著生命科學(xué)的發(fā)展,醫(yī)學(xué)的進(jìn)步,我國人民生活水平顯著提高,威脅人類健康的傳染性疾病得到了有效控制。然而隨著壽命的延長和生存環(huán)境的影響等,腫瘤已成為威脅我國人民健康和生命的重要因素�；蚪M的不穩(wěn)定性造成了腫瘤細(xì)胞的高度變異性,使其難于防治。據(jù)估算我國每年用于腫瘤診治的花費(fèi)高達(dá)千億元,給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn),對腫瘤的治療具有重要意義。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)特異性降解的主要途徑,參與細(xì)胞內(nèi)多種過程,如基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生以及炎癥的過程等。去泛素化酶使得泛素化修飾成為可逆的過程,確保了細(xì)胞中生命活動的動態(tài)平衡。近年來,隨著人們對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演角色的深入研究,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)已成為一種新的腫瘤治療靶點(diǎn)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近幾年興起的第三代人工核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)。該系統(tǒng)由規(guī)律成簇間隔回文重復(fù)序列以及其相關(guān)蛋白9所組成,與之前的第一代鋅指核酸酶（ZFN）和第二代類轉(zhuǎn)錄因子激活效應(yīng)物人工核酸酶（TALEN）相比具有構(gòu)建方法簡單快捷、突變效率高、成本低廉、適用范圍廣等優(yōu)勢,已經(jīng)成為科學(xué)研究...
【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學(xué)院北京市
【文章頁數(shù)】：66 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作用機(jī)制Figure1TheprincipleofCRISPR/Cas9geneeditingtechnology
中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院受到外界刺激導(dǎo)致 DNA 發(fā)生損 蛋白，導(dǎo)致 PDCD5 蛋白在細(xì)胞中P53 蛋白形成四聚體，作用于 DN路，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[22, 23]。研性進(jìn)程相關(guān)，也就是說當(dāng) OTUD凋亡（圖 2）。然而在我的研究 OTUD5 基因之后，細(xì)胞在未經(jīng)試圖對這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)一步研究
圖 3 A.熒光顯微鏡下觀察 Cas9-GFP 腺病毒感染 MDA-MB-231 細(xì)胞（10×20）；B. T7E1實(shí)驗(yàn)和 Western Blot 結(jié)果；C. MTS 檢測細(xì)胞生長結(jié)果；D.細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Figure 3 A. Microscopic observation of Cas9-GFP adenovirus infected MDA-MB-231 cells(10 ×20); B. Results of T7E1 experiment and Western Blot; C. Cell growth curve; D. Cell colonyformation experiment.3.3 構(gòu)建一體化 LentiCRISPR v2-OTUD5-gRNA，在 MDA-MB-231 細(xì)胞中檢測的 OTUD5 基因敲低后細(xì)胞狀況通過多個 gRNA 的共同檢測，避免了細(xì)胞生長受到抑制這一現(xiàn)象是由于OTUD5-gRNA0 的脫靶效應(yīng)來造成的。在 OTUD5 基因的不同區(qū)域又分別設(shè)計(jì)了4 條 sgRNA，連同 E3 庫中的 gRNA0共 5 條 sgRNA，利用更為簡便的 LentiCRISPR的系統(tǒng)對 OTUD5 基因進(jìn)行敲除（圖 4A），并同樣使用經(jīng)典細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn) OTUD5 蛋白能夠?qū)?xì)胞增殖產(chǎn)生影響，蛋白水平敲低越徹底細(xì)胞增殖抑制越明顯（圖 4B，4C）。這就說明 OTUD5 蛋白可以調(diào)控細(xì)胞增殖這一現(xiàn)
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]慢病毒介導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子XⅠ過表達(dá)及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[J]. 程凱,孫浩杰,張明智,沈麗. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2016(11)
[2]CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌和噬菌體的共進(jìn)化[J]. 李鐵民,杜波. 遺傳. 2011(03)
碩士論文
[1]腺病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和BioID在研究體內(nèi)蛋白相互作用中的應(yīng)用[D]. 趙泉丞.安徽醫(yī)科大學(xué) 2015
本文編號：3499229
【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學(xué)院北京市
【文章頁數(shù)】：66 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作用機(jī)制Figure1TheprincipleofCRISPR/Cas9geneeditingtechnology
中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院受到外界刺激導(dǎo)致 DNA 發(fā)生損 蛋白，導(dǎo)致 PDCD5 蛋白在細(xì)胞中P53 蛋白形成四聚體，作用于 DN路，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[22, 23]。研性進(jìn)程相關(guān)，也就是說當(dāng) OTUD凋亡（圖 2）。然而在我的研究 OTUD5 基因之后，細(xì)胞在未經(jīng)試圖對這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)一步研究
圖 3 A.熒光顯微鏡下觀察 Cas9-GFP 腺病毒感染 MDA-MB-231 細(xì)胞（10×20）；B. T7E1實(shí)驗(yàn)和 Western Blot 結(jié)果；C. MTS 檢測細(xì)胞生長結(jié)果；D.細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Figure 3 A. Microscopic observation of Cas9-GFP adenovirus infected MDA-MB-231 cells(10 ×20); B. Results of T7E1 experiment and Western Blot; C. Cell growth curve; D. Cell colonyformation experiment.3.3 構(gòu)建一體化 LentiCRISPR v2-OTUD5-gRNA，在 MDA-MB-231 細(xì)胞中檢測的 OTUD5 基因敲低后細(xì)胞狀況通過多個 gRNA 的共同檢測，避免了細(xì)胞生長受到抑制這一現(xiàn)象是由于OTUD5-gRNA0 的脫靶效應(yīng)來造成的。在 OTUD5 基因的不同區(qū)域又分別設(shè)計(jì)了4 條 sgRNA，連同 E3 庫中的 gRNA0共 5 條 sgRNA，利用更為簡便的 LentiCRISPR的系統(tǒng)對 OTUD5 基因進(jìn)行敲除（圖 4A），并同樣使用經(jīng)典細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn) OTUD5 蛋白能夠?qū)?xì)胞增殖產(chǎn)生影響，蛋白水平敲低越徹底細(xì)胞增殖抑制越明顯（圖 4B，4C）。這就說明 OTUD5 蛋白可以調(diào)控細(xì)胞增殖這一現(xiàn)
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]慢病毒介導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子XⅠ過表達(dá)及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[J]. 程凱,孫浩杰,張明智,沈麗. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2016(11)
[2]CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌和噬菌體的共進(jìn)化[J]. 李鐵民,杜波. 遺傳. 2011(03)
碩士論文
[1]腺病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和BioID在研究體內(nèi)蛋白相互作用中的應(yīng)用[D]. 趙泉丞.安徽醫(yī)科大學(xué) 2015
本文編號：3499229
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