豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬成員豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。該病的主要臨床特征為嚴(yán)重腹瀉、脫水及迅速消瘦,2周齡以下仔豬死亡率可達(dá)100%,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前,TGE主要通過(guò)接種疫苗來(lái)進(jìn)行預(yù)防控制,但是近年來(lái)流行的病毒處在一個(gè)毒力和生物學(xué)特性不斷變異的動(dòng)態(tài)過(guò)程中,傳統(tǒng)疫苗已經(jīng)達(dá)不到抵抗自然流行毒株的效果。本研究對(duì)我國(guó)河北地區(qū)的TGEV流行毒株進(jìn)行了分離鑒定,并獲得一株穩(wěn)定的細(xì)胞傳代毒株;對(duì)該分離毒株S、M基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析,并探究了細(xì)胞自噬對(duì)該TGEV流行株復(fù)制的影響。本研究成果不僅為T(mén)GEV流行毒株致病機(jī)理等提供重要的理論基礎(chǔ)而且對(duì)新型疫苗的研發(fā)上具有重要意義。本研究從河北某地采集臨床表現(xiàn)為腹瀉的仔豬糞便及小腸內(nèi)容物,RT-PCR檢測(cè)為T(mén)GEV陽(yáng)性的病料處理后接種到PK-15細(xì)胞上進(jìn)行傳代,在盲傳至第5代時(shí)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變。經(jīng)RT-PCR檢測(cè),細(xì)胞培養(yǎng)物為T(mén)GEV 陽(yáng)性,P... 

【文章來(lái)源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ＴＧＥＶ病毒粒子示意圖［１３］??Ｆｉｇ．?１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＴＧＥＶ?ｖｉｒｕｓ?ｐａｒｔｉｃｌｅｓ??

的影響???３結(jié)果與分析??３．１病料的檢測(cè)結(jié)果??將實(shí)驗(yàn)室收集的２０１７年９月？２０１８年９月年河北不同豬場(chǎng)４２份腹瀉疑似病料研磨后離心，??得到上清液分別使用ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ特異性引物分別進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)??果顯示，４．８％?（２／４２）為?ＴＧＥＶ?陽(yáng)性，４．８％?（２／４２）?ＰＤＣｏＶ?為陽(yáng)性，５２．４％?（２２／４２）?ＰＥＤＶ?為陽(yáng)??性，２．４％?（１／４２）?ＰＲＶ為陽(yáng)性。瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果顯示只有一份病料為ＴＧＥＶ單一感染（圖２），??ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ特異性引物未擴(kuò)增出目的基因。將目的片段膠回收后連接轉(zhuǎn)化，菌液測(cè)序??后結(jié)果顯示該片段為ＴＧＥＶ?Ｍ基因。??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?４?５??２０００?■??１０００?Ｈ??７５０??５０。??２５０??１００?Ｉ??圖２病料ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果??Ｆｉｇ．２?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｅｃｅｓ??Ｍ：?２０００?ＤＮＡ?分子標(biāo)準(zhǔn)量；１：陰性對(duì)照；２：?ＴＧＥＶ?ＰＣＲ?結(jié)果；３：?ＰＥＤＶ?ＰＣＲ?結(jié)果；４：?ＰＤＣｏＶ?ＰＣＲ?結(jié)果；５：??ＰＲＶ?ＰＣＲ?結(jié)果；??Ｌａｎｅ?Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅ?１：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．?Ｌａｎｅ?２：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＴＧＥＶ；３：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＥＤＶ；２：??ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＤＣｏＶ；２：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＲＶ；??３．２病毒的分離鑒定??３．２．１細(xì)胞病變鑒定??將ＲＴ－ＰＣＲ鑒定為ＴＧＥＶ陽(yáng)性，ＰＥＤＶ、ＰＤＣｏＶ

ａｔ?１０ｔｈ?ｐａｓｓａｇｅ?ａｆｔｅｒ?３６ｈ?（１０〇ｘ）??Ａ．未感染病毒的ＰＫ－１５細(xì)胞Ｂ．感染病毒３６ｈ后的ＰＫ－１５細(xì)胞??Ａ．?Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?Ｂ．?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｖｉｒｕｓ?ａｆｔｅｒ?３６ｈ??３．２．２細(xì)胞毒ＲＴ－ＰＣＲ鑒定??將Ｆ１０代細(xì)胞毒培養(yǎng)物和對(duì)照組細(xì)胞上清提取ＲＮＡ，?ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，??結(jié)果顯示，Ｆ１０代細(xì)胞毒擴(kuò)增出與預(yù)期擴(kuò)增片段大小（３９６ｂｐ）?—致的片段（圖４），而ＰＥＤＶ、??ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ檢測(cè)結(jié)果均為陰性。對(duì)照組細(xì)胞所有病毒檢測(cè)均為陰性。可以證明本試驗(yàn)細(xì)胞分離??的病毒為ＴＧＥＶ，命名為ＴＧＥＶＨＢ－ＦＰ株。??ｂｐ?Ｍ?１?２??ＩＩ—??２０００??１０００??７５０??■??２５０??屬??圖４?ＴＧＥＶ分離株ＨＢ－ＦＰＭ基因片段ＰＣＲ產(chǎn)物??Ｆｉｇ．４?ＲＴ－ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ＴＧＥＶ?ｉｓｏｌａｔｅ?ＨＢ－ＦＰ?Ｍ?ｇｅｎｅ?ｆｒａｇｅｎｔ??Ｍ：?２０００?ＤＮＡ分子標(biāo)準(zhǔn)量；１：第１０代細(xì)胞培養(yǎng)物ＰＣＲ結(jié)果；２：陰性對(duì)照??Ｌａｎｅ?Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅ?１：?ｔｈｅ?ｔｅｎｔｈ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｅｌｌ?ｃｕｌｔｕｒｅ，?Ｌａｎｅ?２：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ??２４??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]1株豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 李曉楠,唐青海,李羽,王瑾,姚倫廣,闞云超,楊海.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017(08)
[2]豬流行性腹瀉病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 羅亞坤,梁琳,王靜,劉存,劉琪,劉暢,藺文成,崔尚金.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2017(02)
[3]豬四種病毒性腹瀉病原多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 熊年年,陶潔,張清真,張春玲,李本強(qiáng),常宏賞,劉惠莉.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2016(08)
[4]豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其S基因分子生物學(xué)特征的分析[J]. 白云云,葛旭影,高睿澤,李訓(xùn)良,任玉東,任曉峰,李廣興,宋銘忻.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2016(03)
[5]豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及S基因進(jìn)化分析[J]. 孫秋艷,郭洪梅,沈美艷,王志遠(yuǎn).  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2015(07)
[6]豬傳染性胃腸炎病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 高睿澤,白云云,李訓(xùn)良,任玉東,任曉峰,李廣興,路義鑫.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2015(06)
[7]鑒別豬流行性腹瀉疫苗毒株與野毒株巢式PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 劉琪,馮曉聲,周如月,賈愛(ài)卿,王貴平.  廣東畜牧獸醫(yī)科技. 2015(02)
[8]豬傳染性胃腸炎的正確診斷及防治[J]. 張雷.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2013(10)
[9]細(xì)胞自噬與病毒感染[J]. 陶冶,任曉峰.  病毒學(xué)報(bào). 2013(01)
[10]豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）福建分離株核衣殼蛋白基因（N）的克隆與表達(dá)分析[J]. 王劭,朱小麗,朱曉琳,陳少鶯,林鋒強(qiáng),陳仕龍,程曉霞,李兆龍,江斌.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2013(01)

博士論文
[1]豬圓環(huán)病毒2型感染誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞自噬機(jī)制研究[D]. 朱炳林.浙江大學(xué) 2012
[2]豬傳染性胃腸炎病毒的分子診斷與免疫研究[D]. 蘭喜.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2006

碩士論文
[1]豬丁型冠狀病毒檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 羅尚星.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]豬丁型冠狀病毒HB-BD株分離鑒定及生物學(xué)特性研究[D]. 劉寶京.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[3]豬傳染性胃腸炎流行毒株的分離鑒定及全基因組分析[D]. 朱蘊(yùn)暖.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2017
[4]豬δ冠狀病毒重組N蛋白間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)[D]. 蘇明俊.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 2017
[5]豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立與應(yīng)用[D]. 徐向偉.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[6]豬傳染性胃腸炎病毒分離及部分特性鑒定[D]. 徐靜.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[7]豬傳染性胃腸炎病毒N基因的熒光定量PCR檢測(cè)方法建立及初步應(yīng)用[D]. 李蕊彤.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[8]豬偽狂犬病毒gE基因亞克隆、原核表達(dá)及ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[D]. 裴麗華.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[9]豬傳染性胃腸炎病毒LJ-12株的分離及鑒定[D]. 姜春霞.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[10]傳染性胰腺壞死病毒VP2抗原表位區(qū)間接免疫熒光方法的建立[D]. 王健楠.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



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