豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬成員豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。該病的主要臨床特征為嚴重腹瀉、脫水及迅速消瘦,2周齡以下仔豬死亡率可達100%,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。目前,TGE主要通過接種疫苗來進行預(yù)防控制,但是近年來流行的病毒處在一個毒力和生物學(xué)特性不斷變異的動態(tài)過程中,傳統(tǒng)疫苗已經(jīng)達不到抵抗自然流行毒株的效果。本研究對我國河北地區(qū)的TGEV流行毒株進行了分離鑒定,并獲得一株穩(wěn)定的細胞傳代毒株;對該分離毒株S、M基因進行了遺傳進化分析,并探究了細胞自噬對該TGEV流行株復(fù)制的影響。本研究成果不僅為TGEV流行毒株致病機理等提供重要的理論基礎(chǔ)而且對新型疫苗的研發(fā)上具有重要意義。本研究從河北某地采集臨床表現(xiàn)為腹瀉的仔豬糞便及小腸內(nèi)容物,RT-PCR檢測為TGEV陽性的病料處理后接種到PK-15細胞上進行傳代,在盲傳至第5代時出現(xiàn)典型的細胞病變。經(jīng)RT-PCR檢測,細胞培養(yǎng)物為TGEV 陽性,P... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ＴＧＥＶ病毒粒子示意圖［１３］??Ｆｉｇ．?１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＴＧＥＶ?ｖｉｒｕｓ?ｐａｒｔｉｃｌｅｓ??

的影響???３結(jié)果與分析??３．１病料的檢測結(jié)果??將實驗室收集的２０１７年９月？２０１８年９月年河北不同豬場４２份腹瀉疑似病料研磨后離心，??得到上清液分別使用ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ特異性引物分別進行ＲＴ－ＰＣＲ檢測，檢測結(jié)??果顯示，４．８％?（２／４２）為?ＴＧＥＶ?陽性，４．８％?（２／４２）?ＰＤＣｏＶ?為陽性，５２．４％?（２２／４２）?ＰＥＤＶ?為陽??性，２．４％?（１／４２）?ＰＲＶ為陽性。瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果顯示只有一份病料為ＴＧＥＶ單一感染（圖２），??ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ特異性引物未擴增出目的基因。將目的片段膠回收后連接轉(zhuǎn)化，菌液測序??后結(jié)果顯示該片段為ＴＧＥＶ?Ｍ基因。??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?４?５??２０００?■??１０００?Ｈ??７５０??５０。??２５０??１００?Ｉ??圖２病料ＰＣＲ擴增結(jié)果??Ｆｉｇ．２?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｅｃｅｓ??Ｍ：?２０００?ＤＮＡ?分子標準量；１：陰性對照；２：?ＴＧＥＶ?ＰＣＲ?結(jié)果；３：?ＰＥＤＶ?ＰＣＲ?結(jié)果；４：?ＰＤＣｏＶ?ＰＣＲ?結(jié)果；５：??ＰＲＶ?ＰＣＲ?結(jié)果；??Ｌａｎｅ?Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅ?１：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．?Ｌａｎｅ?２：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＴＧＥＶ；３：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＥＤＶ；２：??ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＤＣｏＶ；２：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＲＶ；??３．２病毒的分離鑒定??３．２．１細胞病變鑒定??將ＲＴ－ＰＣＲ鑒定為ＴＧＥＶ陽性，ＰＥＤＶ、ＰＤＣｏＶ

ａｔ?１０ｔｈ?ｐａｓｓａｇｅ?ａｆｔｅｒ?３６ｈ?（１０〇ｘ）??Ａ．未感染病毒的ＰＫ－１５細胞Ｂ．感染病毒３６ｈ后的ＰＫ－１５細胞??Ａ．?Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?Ｂ．?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｖｉｒｕｓ?ａｆｔｅｒ?３６ｈ??３．２．２細胞毒ＲＴ－ＰＣＲ鑒定??將Ｆ１０代細胞毒培養(yǎng)物和對照組細胞上清提�。遥危�，?ＲＴ－ＰＣＲ擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，??結(jié)果顯示，Ｆ１０代細胞毒擴增出與預(yù)期擴增片段大�。ǎ常梗叮猓穑�?—致的片段（圖４），而ＰＥＤＶ、??ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ檢測結(jié)果均為陰性。對照組細胞所有病毒檢測均為陰性�？梢宰C明本試驗細胞分離??的病毒為ＴＧＥＶ，命名為ＴＧＥＶＨＢ－ＦＰ株。??ｂｐ?Ｍ?１?２??ＩＩ—??２０００??１０００??７５０??■??２５０??屬??圖４?ＴＧＥＶ分離株ＨＢ－ＦＰＭ基因片段ＰＣＲ產(chǎn)物??Ｆｉｇ．４?ＲＴ－ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ＴＧＥＶ?ｉｓｏｌａｔｅ?ＨＢ－ＦＰ?Ｍ?ｇｅｎｅ?ｆｒａｇｅｎｔ??Ｍ：?２０００?ＤＮＡ分子標準量；１：第１０代細胞培養(yǎng)物ＰＣＲ結(jié)果；２：陰性對照??Ｌａｎｅ?Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅ?１：?ｔｈｅ?ｔｅｎｔｈ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｅｌｌ?ｃｕｌｔｕｒｅ，?Ｌａｎｅ?２：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ??２４??

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本文編號：3458544