發(fā)布時間：2021-10-25 06:56

　　油橄欖（Olea europaea L.）屬于木犀科（Oleaceae）,是世界上一種重要的優(yōu)質(zhì)木本油料樹種。油橄欖果實(shí)經(jīng)壓榨所得的橄欖油是目前世界上公認(rèn)的最為健康的食用油,具有極佳的天然保健功效與美容功效,被譽(yù)為“液體黃金”、“植物油皇后”。油橄欖中富含的黃酮是一類多酚化合物,在植物生命活動中發(fā)揮著重要的生理功能,此外還可以作為藥物具有多種藥理作用,因此具有十分重要的開發(fā)潛力和研究價值。黃酮類化合物是植物苯丙烷代謝途徑中的次生代謝物,苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase, PAL）、查爾酮合酶（chalcone synthase, CHS）和查爾酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase, CHI）是黃酮合成代謝途徑中的三個關(guān)鍵酶,對植物中黃酮類物質(zhì)的積累有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)綜合運(yùn)用同源克隆、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）、融合引物嵌套PCR （fusion primer and nested integrated PCR, FPNI-PCR）... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 油橄欖概述
    2 黃酮類化合物的研究進(jìn)展
        2.1 黃酮的種類和分布
        2.2 油橄欖中的黃酮
        2.3 黃酮的生物學(xué)功能
            2.3.1 黃酮對植物的生理作用
            2.3.2 黃酮的藥理作用
        2.4 黃酮的合成代謝途徑
    3 黃酮合成代謝途徑中關(guān)鍵酶及其基因的研究進(jìn)展
        3.1 苯丙氨酸解氨酶及其基因的研究進(jìn)展
        3.2 查爾酮合酶及其基因的研究進(jìn)展
        3.3 查爾酮異構(gòu)酶及其基因的研究進(jìn)展
    4 一種改進(jìn)型染色體步移技術(shù)
    5 研究的目的與意義
第二章 油橄欖PAL、CHS、CHI全長的克隆及序列分析
    1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
        1.1 油橄欖葉片
        1.2 主要儀器設(shè)備
        1.3 主要試劑和溶液
        1.4 菌株和培養(yǎng)基
    2 方法
        2.1 油橄欖基因組DNA的提取
        2.2 油橄欖總RNA的提取及cDNA第一鏈制備
            2.2.1 油橄欖葉片總RNA的提取
            2.2.2 制備cDNA第一鏈
        2.3 油橄欖PAL、CHS、CHI的克隆
            2.3.1 PCR引物的設(shè)計(jì)
            2.3.2 基因保守片段的克隆
            2.3.3 基因5'端未知序列的克隆
            2.3.4 基因3'端未知序列的克隆
            2.3.5 基因全長的克隆
        2.4 油橄欖PAL、CHS、CHI的生物信息學(xué)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 油橄欖葉片總DNA及總RNA的提取
        3.2 油橄欖PAL的克隆及序列分析
            3.2.1 油橄欖PAL的克隆
            3.2.2 OePAL的核苷酸序列分析
            3.2.3 OePAL的氨基酸序列分析
            3.2.4 OePAL蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測
            3.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
        3.3 油橄欖CHS的克隆及序列分析
            3.3.1 油橄欖CHS的克隆
            3.3.2 OeCHS的核苷酸序列分析
            3.3.3 OeCHS的氨基酸序列分析
            3.3.4 OeCHS蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測
            3.3.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
        3.4 油橄欖CHI的克隆及序列分析
            3.4.1 油橄欖CHI的克隆
            3.4.2 OeCHI的核苷酸序列分析
            3.4.3 OeCHI的氨基酸序列分析
            3.4.4 OeCHI蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測
            3.4.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
    4 討論
        4.1 OePAL、OeCHS、OeCHI的結(jié)構(gòu)
        4.2 CHS與CHI之間的關(guān)系
第三章 OePAL在畢赤酵母中的表達(dá)
    1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        1.1 菌種和質(zhì)粒
        1.2 主要儀器設(shè)備
        1.3 主要試劑和溶液
        1.4 培養(yǎng)基
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 克隆OePAL的目的序列
        2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.1 酶切及回收
            2.2.2 目的片段與表達(dá)載體的連接
            2.2.3 轉(zhuǎn)化篩選與鑒定
            2.2.4 pPICZαA-OePAL的線性化
        2.3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33
            2.3.1 畢赤酵母X33感受態(tài)的制備
            2.3.2 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞
            2.3.3 重組酵母陽性轉(zhuǎn)化子的篩選
        2.4 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化、檢測
            2.4.1 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.4.2 重組酶的分離純化
            2.4.3 重組酶的SDS-PAGE檢測
        2.5 蛋白質(zhì)含量的測定
            2.5.1 低濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
            2.5.2 酶液中蛋白含量的測定
        2.6 重組6×His-OePAL酶活性的測定
        2.7 重組6×His-OePAL酶學(xué)性質(zhì)研究
            2.7.1 溫度對重組酶活力的影響
            2.7.2 pH值對重組酶活力的影響
            2.7.3 金屬離子對重組酶活力的影響
            2.7.4 重組酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)K_m的測定
    3 結(jié)果與分析
        3.1 OePAL目的序列的克隆
        3.2 重組質(zhì)粒pPICZαA-OePAL的鑒定
        3.3 畢赤酵母X33/pPICZαA-OePAL陽性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定
        3.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測
        3.5 重組酶的比活力測定
            3.5.1 蛋白含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
            3.5.2 計(jì)算重組酶的比活力
        3.6 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
            3.6.1 溫度對重組酶活力的影響
            3.6.2 pH值對重組酶活力的影響
            3.6.3 金屬離子對重組酶活力的影響
            3.6.4 重組酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)K_m的測定
    4 討論
        4.1 表達(dá)宿主菌及載體的選用
        4.2 重組質(zhì)粒pPICZαA-OePAL的構(gòu)建
        4.3 重組OePAL的活性及酶學(xué)性質(zhì)分析
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]膜莢黃芪苯丙氨酸解氨酶基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)[J]. 張健慧,王首鋒.  浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2014(01)
[2]紅冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因pal在大腸桿菌中的克隆與表達(dá)[J]. 侯文婷,張梁,顧正華,丁重陽,石貴陽.  生物加工過程. 2012(05)
[3]四川省油橄欖引種品種果實(shí)含油率及其脂肪酸分析[J]. 朱萬澤,范建容,彭建國,楊洪彬,楊本年,何明波.  林業(yè)科學(xué). 2010(08)
[4]轉(zhuǎn)查爾酮合酶基因?qū)煵莼ㄉ盎ㄆ鞴俚挠绊慬J]. 夏玉鳳,耿曉娜,王萬雙,趙寶華.  生物技術(shù)通報(bào). 2010(01)
[5]三種油橄欖葉片中多酚含量的季節(jié)動態(tài)變化研究[J]. 梁劍.  北方園藝. 2010(01)
[6]百合鱗莖苯丙氨酸解氨酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 孫紅梅,趙爽,王春夏,王錦霞,趙波,陳麗靜.  園藝學(xué)報(bào). 2008(11)
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[10]大豆苯丙氨酸解氨酶（PAL）在大腸桿菌中的重組表達(dá)及活性鑒定[J]. 宋柬,馬會勤,郝佳,任發(fā)政,陳尚武.  食品科學(xué). 2006(07)

碩士論文
[1]鹽膚木苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其功能性質(zhì)研究[D]. 武敏.山西大學(xué) 2012
[2]蕓薹屬查爾酮異構(gòu)酶基因家族的克隆與功能鑒定[D]. 曹廷.西南大學(xué) 2011
[3]國產(chǎn)油橄欖葉中酚類化合物的分析與表征[D]. 王百川.大連工業(yè)大學(xué) 2011
[4]大豆黃酮及半胱胺對鵝脂肪代謝的影響[D]. 馬海田.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002



本文編號：3456878