NAC是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、花藥開裂及逆境脅迫中具有重要作用。玉米生育期內(nèi)由于高溫、高濕等環(huán)境因素造成花藥不能開裂從而嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量。擬南芥中的NAC類基因不僅參與葉片的發(fā)育,還調(diào)控花藥開裂。而玉米中的NAC類基因研究較少,為了研究玉米中調(diào)控葉片和花藥開裂的NAC類基因,本文對(duì)玉米中的NAC類基因進(jìn)行篩選,篩選出ZmNAC19基因主要在葉里面表達(dá),ZmNAC31基因主要在雄穗和葉里面表達(dá)。將篩選出的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析、構(gòu)建GFP融合蛋白載體和過(guò)表達(dá)載體、獲取過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥并進(jìn)行表型分析。主要成果如下:1.通過(guò)比對(duì)擬南芥中NST蛋白序列,從玉米中篩選出100個(gè)NAC基因,又結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出33個(gè)基因,最后通過(guò)RT-PCR篩選出在葉里表達(dá)的ZmNAC19基因和在雄穗里表達(dá)的ZmNAC31基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析ZmNAC19和ZmnAC31基因的啟動(dòng)子序列,這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)均有NAC轉(zhuǎn)錄的順式作用元件,尤其存在與次生壁增厚的調(diào)控元件,說(shuō)明這兩個(gè)基因可能參與了植物的次生壁增厚;對(duì)ZmNAC19和ZmNAC31蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)出... 

【文章來(lái)源】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

玉米花藥發(fā)育14個(gè)時(shí)期的細(xì)胞學(xué)觀察（引自田有輝和萬(wàn)向元,2018）

第一章文獻(xiàn)綜述12圖1-2擬南芥花藥的隔膜和裂縫區(qū)（引自Wilsonetal.,2011）Fig.1-2SeptumandstomiumregionofanArabidopsisanther注：A：小孢子釋放后的裂縫區(qū)；箭頭表示內(nèi)層細(xì)胞次生增厚帶。B：隔膜和裂縫溶解時(shí)的結(jié)構(gòu)圖。En：內(nèi)皮層St：裂縫S：隔膜Note:A:Thestomiumregionaftermicrosporerelease;bandsofsecondarythckening(arrows)canbeobservedintheendothecium.B:Thestomiumregionatantherdehiscence,afterseptumandstomiumlysis.En,endothecium;St,stomium,S,septum.BonnerandDickinson（1989）通過(guò)番茄的顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，孢子囊間隔的發(fā)育和表皮細(xì)胞的分化是由孢子細(xì)胞和絨氈層的分化引起的，之后是內(nèi)皮層的分化。內(nèi)皮層細(xì)胞進(jìn)行選擇性的次生增厚，而小室之間的隔膜和裂縫區(qū)域不增厚（Koltunowetal.,1990）。這說(shuō)明內(nèi)皮層的選擇性次生增厚對(duì)于花藥的開裂至關(guān)重要�；ㄋ庨_裂之前，隔膜經(jīng)歷細(xì)胞分裂和細(xì)胞編程性死亡（Marianaetal.,1990）。裂縫對(duì)花藥開裂的重要性已經(jīng)在番茄的細(xì)胞消融中得以證實(shí)（BealsandGoldberg,1997）。他們指出，裂縫特異性消融后會(huì)使花藥開裂失敗。雙子葉模式植物擬南芥（Sandersetal.,1999）與茄科植物（BonnerandDickinson,1989；Sandersetal.,2005），單子葉植物水稻（Matsuietal.,1999）和玉米（Keijzeretal.,1996）的花藥開裂過(guò)程相似，這說(shuō)明控制花藥開裂的相關(guān)基因在不同的物種中具有高度保守性。但是，不同物種之間的花藥結(jié)構(gòu)也存在著細(xì)小的差異，從而影響最終開裂的位置。由于不同物種花藥結(jié)構(gòu)存在細(xì)小差異，從形態(tài)和組織學(xué)特征方面，研究人員分析了30種茄科植物的花藥開裂和裂縫結(jié)構(gòu)，觀察到三種主要的開裂機(jī)制：（a）孔裂，通過(guò)一個(gè)小的頂端孔開裂；（b）頂端口縱向開裂，有一個(gè)頂端孔，但開口繼續(xù)向下縱向分

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文21利用在線工具TMHMMServer分析ZmNAC19和ZmNAC31蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；利用在線工具SignalPServer分析ZmNAC19和ZmNAC31蛋白質(zhì)N端的信號(hào)肽。2.1.2.8玉米ZmNAC19和ZmNAC31蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用在線工具ProtParam、SOPMA和SWISSMODEL對(duì)ZmNAC19和ZmNAC31進(jìn)行蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。2.2結(jié)果與分析2.2.1玉米各組織總RNA的提取及花藥、葉片高表達(dá)NAC基因的鑒定根據(jù)RNA提取試劑盒的說(shuō)明書提取玉米拔節(jié)期的根、莖、葉，花絲，授粉前的雌穗，抽穗后的雄穗和形成期的種子的總RNA。結(jié)果如圖2-1所示，可以清晰地看見28S和18S兩條帶，說(shuō)明RNA提取成功。測(cè)定A260/A280后，發(fā)現(xiàn)所有樣品RNA純度都較好，可以用于下一步的反轉(zhuǎn)錄以及RT-PCR試驗(yàn)。圖2-1玉米不同組織的總RNAFig.2-1TotalRNApreparationfromdifferenttissueofmaize注：Root：根；Stem：莖；Leaf：葉；Pistil：雌穗；Silk：花絲；Tassel：雄穗；Seed：種子因?yàn)镸itsuda等人（2007）在研究NST1和NST2基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因在調(diào)節(jié)葉片和花藥的次生壁增厚過(guò)程中發(fā)揮重要功能，以及在水稻、小麥中也有研究表明NAC類基因調(diào)節(jié)植物葉片的衰老和花藥開裂，因此，通過(guò)比對(duì)擬南芥長(zhǎng)角果開裂相關(guān)基因NST的蛋白質(zhì)序列，在玉米數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出100個(gè)NAC類基因，結(jié)合相似性大小與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中葉和花藥中的表達(dá)量多少，從初次篩選的100個(gè)基因中篩選出33個(gè)基因可能與花藥的開裂、葉片的發(fā)育有關(guān)。為了檢測(cè)該33個(gè)基因在玉米各個(gè)組織中的表達(dá)量，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再將篩選出的33個(gè)基因進(jìn)行RT-PCR水平檢測(cè)，33個(gè)基因在不同組織中的表達(dá)水平如表2-2所示。

【參考文獻(xiàn)】：
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