基因表達的原位檢測能夠在細胞和組織層面上提供其空間位置信息,受到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。但同一基因通過選擇性剪接可能產(chǎn)生多個具有不同時空特異表達的剪接體,最終不同的剪接體翻譯成蛋白并行使生物學(xué)功能。因此,探索基因選擇性剪接的空間表達,具有重要的生物學(xué)意義。本文旨在開發(fā)一種新型RNA多重原位檢測技術(shù),并應(yīng)用于造血干細胞中的具有高度細胞特異性的基因選擇性剪接的研究中。首先,我們利用人類血液腫瘤細胞系K562作為研究的基礎(chǔ)模型,其能分化成為成熟血細胞（Erythroblasts,EBs）和巨核細胞（Megakaryocytes,MKs）,通過流式細胞術(shù)檢測K562的分化效率,利用RNA原位檢測技術(shù)對特異性表達的基因進行細胞層面的空間定位,并與轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）所得的基因表達值進行比較,證實方法對于基因表達檢測的可行性。其次,基于K562,EBs和MKs的RNA-seq數(shù)據(jù)分析,我們挑選選擇性剪接事件進行RNA原位檢測實驗,并進一步優(yōu)化為RNA多重原位檢測。結(jié)合測序分析的結(jié)果選擇12種環(huán)狀RNA（Circular RNA,circRNA）在K562、EBs這兩種細胞系上進行檢測。利用該方法... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同類型的選擇性剪接原理示意圖

第1章緒論3細胞均源自于少量的造血干細胞（Hematopoieticstemcells,HSCs）增值分化的造血祖細胞（Hematopoieticstemandprogenitorcell,HSPC）[37]。HSCs具有高度自我更新與自我分化兩大特性，維持著人體的穩(wěn)態(tài)與再生。如圖1.2所示，根據(jù)造血干細胞的分化時期及功能作用，造血干細胞分為長效重建造血干細胞（Long-termhematopoieticstemcell,LT-HSC）和短效重建造血干細胞（Short-termhematopoieticstemcell,ST-HSC）。進而ST-HSC通過其不對稱的分化，產(chǎn)生多能祖細胞（Multipotentprogenitorcell,MPP）[39]，MPP進一步分化為共同髓系祖細胞（Commonmyeloidprogenitorcell,CMP）和共同淋巴系祖細胞（CommonlympHoidprogenitorcell,CLP），接下來CMP進一步分化成各種髓系祖細胞。髓系多能祖細胞分化成巨核細胞/紅細胞祖細胞（Megakaryocyteerythrocyteprogenitor,MEP）和粒、單核系祖細胞（Granulocytemonocyteprogenitor,GMP），這些祖細胞進一步增殖分化成為成熟血細胞和巨核細胞[40]，而與之對應(yīng)的CLP分化成各種類型的淋巴細胞，如自然殺傷細胞（Naturalkillercell,NKcell）及T淋巴細胞和B淋巴細胞。圖1.2骨髓中造血干細胞分化類型

華僑大學(xué)碩士學(xué)位論文6環(huán)擴增（Rollingcircleamplification,RCA）[109-110]放大技術(shù)相結(jié)合的原理，實現(xiàn)單分子RNA的原位檢測技術(shù)。PLP在1994年由NilssonM等人[111]提出，他們將鎖式探針設(shè)計為兩端為與靶序列的互補配對的序列，中間為無關(guān)序列的形式，最后利用T4DNAligase連接成環(huán)。UlfLandegren的科研團隊[112]在實驗中，對鎖式探針與靶序列進行對比，在B球蛋白基因中成功對其進行分型，從而證實了PLP的可行性。RCA是一種利用滾環(huán)復(fù)制方式的擴增技術(shù)，結(jié)合Phi29DNA聚合酶[113-116]，能夠?qū)⑻囟ǖ腄NA、RNA分子的靶核酸信號放大[117-120]，最高可達到107放大倍數(shù)，并且由于其具有極高靈敏度等特點，目前RCA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于線粒體DNA[124-125]、mRNA[126]及miRNA[121-122]等的原位檢測。第四代的原位測序技術(shù)（Insitusequencing,ISS）正是基于PLP與RCA的結(jié)合原理開發(fā)應(yīng)用的。2014年KeR等人[123]利用ISS首次實現(xiàn)了對固定細胞和乳腺癌組織中長達四個堿基的單分子RNA的測序技術(shù)（如圖1.3）。該方法在保留了其空間位置信息之余，又獲取到了目的基因的序列；同時，研究者指出，即使測序長度為四個堿基，仍可以利用熒光標記基團空間排列組合的原理，從而實現(xiàn)對單分子RNA的44=256種的多重原位檢測。圖1.3RNA原位測序原理圖（引自KeR等）


本文編號：3451276