脊椎動(dòng)物消化道內(nèi)棲息著不計(jì)其數(shù)的共生微生物,它們也被稱為是宿主的一個(gè)非常重要的“器官”。腸道微生物在宿主的營(yíng)養(yǎng)與能量代謝、免疫調(diào)控、生長(zhǎng)發(fā)育等方面扮演著重要的角色,腸道菌群的組成與宿主健康息息相關(guān)。無菌動(dòng)物模型和微生物測(cè)序技術(shù)是目前探索動(dòng)物體腸道微生物功能及其與宿主相互關(guān)系的兩大關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái),但是這兩項(xiàng)技術(shù)在實(shí)踐操作中面臨一些挑戰(zhàn):一是無菌動(dòng)物模型接種條件如何確定?二是如何選擇多樣的測(cè)序平臺(tái)以及如何確認(rèn)測(cè)序數(shù)據(jù)可以反映微生物的功能?針對(duì)以上兩個(gè)問題,本論文進(jìn)行如下兩方面的探索:1.無菌斑馬魚接種條件的優(yōu)化無菌動(dòng)物技術(shù)的出現(xiàn)使人類對(duì)腸道微生物的探索進(jìn)入了功能研究時(shí)代。相對(duì)于目前應(yīng)用較多的無菌小鼠模型,無菌斑馬魚因其繁殖能力強(qiáng)、飼養(yǎng)成本低、無菌操作便捷等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)正逐漸成為腸道微生物功能探索的主力軍。將某種/些微生物接種于無菌斑馬魚中,有助于研究者探討微生物對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)、免疫、運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)發(fā)育等方面的調(diào)節(jié)作用。在接種過程中的接種條件包括接種時(shí)間、接種濃度和微生物暴露時(shí)間等都可能影響最終的研究結(jié)果,然而,目前研究中的無菌斑馬魚微生物接種條件多種多樣,如何確定最佳接種條件仍不清楚,這也極大地限制... 

【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：90 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

無菌斑馬魚制作流程[64]

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文13圖2-1.pET-28a(+)質(zhì)粒信息Fig2-1.TheinformationofpET-28a(+)plasmid.枯草芽孢桿菌WB800N的熒光標(biāo)記選用了包含有EGFP基因和氯霉素抗性基因的pHT01質(zhì)粒(BioVectorNTCCInc,Beijing,China，圖2-2）。添加5ug/mL氯霉素(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)在37°C170rpm/分鐘下培養(yǎng)菌液24h,當(dāng)細(xì)菌的OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，添加1μM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(SigmaChemicalCo.St.Louis,MO,USA)繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí)來誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)。圖2-2.pHT01(+)質(zhì)粒信息Fig2-2.TheinformationofpHT01(+)plasmid.分別取1mL大腸桿菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液置于1.5mLEP管中1000rpm/分鐘離心1分鐘，待菌體沉淀于EP管底部，置于熒光顯微鏡下檢測(cè)(SZX16,Olympus,Tokyo,Japan)。1.2.2無菌斑馬魚的制備無菌斑馬魚的制備流程在先前工作的基礎(chǔ)上稍加改造[94]，已經(jīng)在第一章第二節(jié)內(nèi)詳細(xì)記述。1.2.3無菌斑馬魚的單一接種將兩株菌的培養(yǎng)液分別以7500rpm離心10分鐘，將上清液從培養(yǎng)基中除去。繼而將菌體沉淀繼續(xù)在無菌水中洗滌三次，然后用無菌的GZM重懸菌體，

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文14以102CFU/mL至107CFU/mL的最終濃度轉(zhuǎn)移到GF斑馬魚培養(yǎng)基中。用無菌吸管將受精后3天（3daypostfertilization3dpf）和5dpf的GF斑馬魚幼仔分別轉(zhuǎn)入6孔無菌平板(每孔10條)。無菌斑馬魚幼魚一共分為兩組：無菌斑馬魚組與單一接種組。無菌斑馬魚的單一接種是將無菌斑馬魚幼魚暴露在濃度為102-107CFU/mL的大腸桿菌DH5α或濃度為102-106CFU/mL的枯草芽孢桿菌WB800N溶液中,并且將其置于28°C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)。暴露于102CFU/mL到107CFU/mL大腸桿菌的斑馬魚組分別定義為2E、3E、4E、5E、6E、7E組，暴露于102CFU/mL到106CFU/mL枯草芽孢桿菌的斑馬魚組分別定義為2B、3B、4B、5B、6B組。無菌組簡(jiǎn)稱為GF，正常飼養(yǎng)的斑馬魚簡(jiǎn)稱為CONR，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖2-3。圖2-3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Fig.2-3Thedesignofexperiments.1.2.4細(xì)菌定植濃度的檢測(cè)斑馬魚在不同濃度的兩種細(xì)菌中分別暴露24h和48h以后，為了量化每條魚腸道內(nèi)的定植菌數(shù)，將10只斑馬魚幼魚移入1.5mL無菌試管中，用無菌水沖洗10次，去除附著于表面的細(xì)菌。隨后，加入無菌玻璃珠(600mm)和500mL高壓滅菌的PBS(1x)，使用震蕩儀(BIO101/FP120QBioGene)在60Hz的頻率下勻漿30秒，直到將斑馬魚體內(nèi)所有的細(xì)菌都釋放出來。將勻漿后的大腸桿菌細(xì)菌懸浮液梯度稀釋，然后涂布在添加了卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中以檢測(cè)斑馬魚腸道內(nèi)大腸桿菌DH5α的數(shù)量，將枯草芽孢桿菌的梯度稀釋液涂布在含有氯霉素的LB固體培養(yǎng)基中（每個(gè)梯度至少3個(gè)平行）。將細(xì)菌培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中37攝


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