目的:脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）是神經(jīng)移植,治療缺損神經(jīng)的理想型細(xì)胞,但移植后死亡率高是亟待處理的難題。P2X7受體是神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的熱門(mén)靶點(diǎn),已知P2X7受體能夠拯救ATP誘發(fā)的ADSCs死亡,介導(dǎo)雪旺細(xì)胞向髓鞘型分化,促進(jìn)髓鞘形成。本實(shí)驗(yàn)主要研究P2X7受體對(duì)脂肪干細(xì)胞是否具有促進(jìn)其分化為雪旺樣細(xì)胞的作用,對(duì)ADSCs分化后促神經(jīng)再生功能的影響,為神經(jīng)修復(fù)細(xì)胞療法尋覓藥物干預(yù)靶點(diǎn)提供理論根據(jù)。方法:取雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠腹股溝脂肪,Ⅰ型膠原酶消化法分離脂肪干細(xì)胞,培養(yǎng)傳代,選用第三代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用P2X7R（P2X7受體）慢病毒轉(zhuǎn)染第三代未分化脂肪干細(xì)胞（uADSCs）,構(gòu)建uADSCs高表達(dá)P2X7R模型,Western blot驗(yàn)證P2X7R-uADSCs轉(zhuǎn)染是否成功。MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后ADSCs增殖能力。將uADSCs和P2X7R-uADSCs以1×10⁵/mL的密度種入六孔板中,加入1 mMβ-巰基乙醇培養(yǎng)24 h,再加入35 ng/mL全反式維甲酸,孵育72 h后,換... 

【文章來(lái)源】：蘭州大學(xué)甘肅省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

所示ADSCs的形態(tài)特征變化

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文P2X7受體調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞分化為雪旺樣細(xì)胞的作用研究23幾乎沒(méi)有熒光；MOI=20時(shí)，少量ADSCs表達(dá)GFP，并且熒光強(qiáng)度較弱；MOI=30的情況下，陽(yáng)性ADSCs數(shù)目和熒光強(qiáng)度均會(huì)增加；當(dāng)MOI=50時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大增，細(xì)胞活力好；MOI=100時(shí)，轉(zhuǎn)染的ADSCs形態(tài)發(fā)生變化，而死亡細(xì)胞增多。結(jié)果顯示，MOI=50時(shí)轉(zhuǎn)染率較高，故可選作本實(shí)驗(yàn)慢病毒載體最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)。圖2不同MOI轉(zhuǎn)染ADSCs72h后GFP熒光表達(dá)。病毒轉(zhuǎn)染后，72h后可見(jiàn)明顯綠色熒光，ADSCs表達(dá)熒光的數(shù)量和強(qiáng)度與MOI呈正相關(guān)。MOI:A=0，B=20，C=30，D=50，E=100。(A、B、C、D：倒置顯微鏡×100，E：倒置顯微鏡×10)Figure2FluorescenceexpressionofGFPinADSCstransfectedwithdifferentMOIfor72h.Aftertransfectionfor72h,obviousgreenfluorescencewasobserved,theamountandintensityoffluorescenceexpressedbyADSCswerepositivelycorrelatedwithMOI.MOI:A=0,B=20,C=30,D=50,E=100.(A.B.C.D:invertedmicroscope×100,E:invertedmicroscope×10)3.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCsADSCs按照1×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于六孔板后，待細(xì)胞融合60%-80%后，棄去培養(yǎng)基，加入5μg/mL的聚凝胺溶液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30min后，再按照MOI=50加入Lenti-CMV-GFP-2A-Puro-BlankLentivirus和P2X7RLentivirus(Rat)(CMV)(pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro)，培養(yǎng)12-16h后，換取新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。MOI=50時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染慢病毒載體Lenti-CMV-GFP-2A-Puro-BlankLentivirus和轉(zhuǎn)染P2X7RLentivirus(Rat)(CMV)(pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro)72h后，uADSCs細(xì)胞的GFP綠色

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文P2X7受體調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞分化為雪旺樣細(xì)胞的作用研究24熒光表達(dá)量，其感染率均可達(dá)90%以上(圖3A.B)。圖3ADSCs熒光表達(dá)。A.GFP-uADSCs；B.P2X7R-uADSCs。MOI=50時(shí)，熒光顯微鏡下觀察熒光，A、B組熒光表達(dá)基本一致。Figure3FluorescenceexpressionofADSCs.A.GFP-uADSCs;B.P2X7R-uADSCs.Thefluorescencewasobservedunderafluorescencemicroscope,andthefluorescenceintensityoftheA,BgroupwasbasicallythesamewhenMOI=50.3.3慢病毒轉(zhuǎn)染uADSCs鑒定慢病毒載體轉(zhuǎn)染uADSCs后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，Westernblot鑒定P2X7R高表達(dá)模型結(jié)果顯示，uADSCs組，GFP-uADSCs對(duì)照組，P2X7R轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均表達(dá)P2X7，uADSCs組和對(duì)照組的蛋白表達(dá)量明顯低于P2X7R轉(zhuǎn)染組（**P＜0.01，***P＜0.001），可證明P2X7R轉(zhuǎn)染成功（圖4）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3442061