發(fā)布時(shí)間：2021-10-05 04:52

　　精子表面的IZUMO1與卵子表面的JUNO之間的相互作用是哺乳動(dòng)物精卵融合的必需條件,但僅有IZUMO1與JUNO相互作用還不足以導(dǎo)致膜融合,因此一定還有一些精子或卵子蛋白可能參與精卵膜融合。為了進(jìn)一步尋找可能同JUNO和IZUMO1這兩個(gè)重要分子有作用的精卵蛋白,實(shí)驗(yàn)室利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行了初步的篩查,篩查后的測(cè)序結(jié)果表明,一個(gè)名為ENO1的蛋白可能與IZUMO1和JUNO存在相互作用。隨后本文用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)鑒定了大鼠ENO1與IZUMO1的相互作用,并用間接免疫熒光技術(shù)觀察了ENO1在大鼠精子和卵子上的定位以及與IZUMO1的共定位。還用抗體抑制和體外受精技術(shù)測(cè)定了ENO1對(duì)小鼠卵子受精的影響,以鑒定ENO1是否可能參與精卵膜融合過(guò)程。實(shí)驗(yàn)先克隆了大鼠eno1的cDNA。構(gòu)建了pGAD-eno1酵母表達(dá)載體與實(shí)驗(yàn)室已有的pGBK-Juno以及pGBK-Izumo1酵母表達(dá)載體進(jìn)行了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明ENO1與IZUMO1存在相互作用,但與JUNO不存在相互作用。構(gòu)建了pCMV-Flag-eno1真核表達(dá)載體,與實(shí)驗(yàn)室已有的pCMV-HA-Izumo1共轉(zhuǎn)染HE... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：91 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

原核表達(dá)載體pET-28a-eno1的構(gòu)建

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文把成功克隆的eno1DNA片段與載體pEASY-Bluntsimple連接后得到重組載體Blunt-eno1，用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI同時(shí)雙酶切原核表達(dá)載體pET-28a和重組載體Blunt-eno1，將雙酶切后的原核表達(dá)載體pET-28a片段和eno1片段連接，最終得到重組pET-28a-eno1原核表達(dá)載體。Figure2.5ConstructionofprokaryoticexpressionvectorpET-28a-eno1Thesuccessfullyclonedeno1DNAfragmentwasligatedintothevectorpEASY-BluntsimpletoobtaintherecombinantvectorBlunt-eno1.TherestrictionenzymesBamHIandSalIwereusedtosimultaneouslydigesttheprokaryoticexpressionvectorpET-28aandtherecombinantvectorBlunt-eno1,thedouble-digestedprokaryoticexpressionvectorpET-28afragmentandeno1fragmentwereligatedtofinallyobtaintherecombinantpET-28a-eno1prokaryoticexpressionvector.②pGEX-eno1質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程如圖2.6。圖2.6原核表達(dá)載體pGEX-eno1的構(gòu)建把成功克隆的eno1DNA片段與載體pEASY-Bluntsimple連接后得到重組載體Blunt-eno1，用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI同時(shí)雙酶切原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和重組載體Blunt-eno1，將雙酶切后的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1片段和eno1片段連接，最終得到重組pGEX-eno1原核表達(dá)載體.Figure2.6ConstructionofprokaryoticexpressionvectorpGEX-eno1Thesuccessfullyclonedeno1DNAfragmentwasligatedwiththevectorpEASY-BluntsimpletoobtaintherecombinantvectorBlunt-eno1.TherestrictionenzymesBamHIandSalIwereusedtodoubledigestthepGEX-eno1Ligase雙酶切BamHISalI雙酶切BamHISalILigase40

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文相同。此時(shí)酵母表達(dá)載體pGAD-eno1構(gòu)建成功，可用后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2.10Blunt-eno1、pGAD-T7與pGAD-eno1雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果A：泳道M：Marker（DL-2000）；泳道1：Blunt-eno1雙酶切產(chǎn)物（1630bp）；泳道2：pGAD-T7雙酶切產(chǎn)物；B：泳道M：Marker（DL-2000）；泳道1：pGAD-eno1雙酶切產(chǎn)物（1630bp）。Figure2.10AgarosegelelectrophoresisidentificationofBlunt-eno1,pGADT7andpGAD-eno1doubledigestedproducts.A:LaneM:Marker(DL-2000);Lane1:doubleenzymedigestionproductofBlunt-eno1(1630bp).Lane2:doubleenzymedigestionproductofpGAD-T7;B:LaneM:Marker(DL-2000);Lane1:doubleenzymedigestionproductofpGAD-eno1(1630bp)3.2.2轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)后菌落PCR鑒定LiAc法制備Y2H、Y187酵母感受態(tài)，在酵母感受態(tài)Y187中轉(zhuǎn)入pGAD-eno1酵母表達(dá)載體，酵母感受態(tài)Y2H中轉(zhuǎn)入pGBK-Juno、pGBK-Izumo1酵母表達(dá)載體。分別挑取SD/-Trp、SD/-Leu固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單菌落的一半，充分溶于0.9%的生理鹽水，沸水浴中5min后置于-20℃冰凍35min。反復(fù)3次后取1μL菌液作為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定，菌落PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2.11。圖A為PCR鑒定轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)Y2H中pGBK-Izumo1的電泳結(jié)果，圖A中特異性條帶位于1000bp左右，符合Izumo1預(yù)期片段1151bp大校圖B為PCR鑒定轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)Y2H中pGBK-Juno的電泳結(jié)果，圖B中特異性條帶位于500-750bp之間，符合Juno預(yù)期片段609bp大校圖C為PCR鑒定轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)Y187中pGAD-eno1的電泳結(jié)果，圖C中特異性條帶位于1500-2000bp之間，符合eno1預(yù)期片段1630bp大校圖2.11結(jié)果表明，pGBK-Juno、pGBK-Izumo1、pGAD-eno1酵母表達(dá)質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。bpM1250020002501001000

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Progress in the biological function of alpha-enolase[J]. Hong Ji,Jianfa Wang,Jingru Guo,Yue Li,Shuai Lian,Wenjin Guo,Huanmin Yang,Fanzhi Kong,Li Zhen,Li Guo,Yanzhi Liu.  Animal Nutrition. 2016(01)



本文編號(hào)：3419038