狼蛛在世界各地分布廣泛,隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、螯肢亞門(mén)、蛛形綱、蜘蛛目,在蜘蛛目中按物種多樣性來(lái)劃分位居第四,其毒液中含有豐富的多肽毒素待開(kāi)展研究。近年來(lái)凝血酶Thrombin是開(kāi)發(fā)促凝與抗凝血藥物的重要靶點(diǎn),ASIC3通道是治療細(xì)胞外酸化所致疼痛的重要靶點(diǎn),Thrombin和ASIC3的調(diào)制劑篩選仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與方向。在前期研究中,已從格氏狼蛛毒液中鑒定出一種新的具有促凝血因子活性及酸敏感離子通道抑制劑多肽毒素LCTX-F2。在凝血因子方面,可以促進(jìn)凝血因子FXa、FXIIa、Thrombin和Kallikrein的酶活力,加快血液的凝固。另外在酸敏感通道方面,LCTX-F2可逆性抑制ASIC1a和ASIC3通道電流,其IC₅₀分別為5.8μM和4.6μM。但LCTX-F2促進(jìn)凝血因子活性和抑制酸通道活性的關(guān)鍵位點(diǎn)尚不清楚。多肽毒素LCTX-F2包含65個(gè)氨基酸殘基,由4對(duì)二硫鍵組成,其相對(duì)分子質(zhì)量為7452 Da,是一個(gè)經(jīng)典的抑制劑半胱氨酸結(jié)（ICK）結(jié)構(gòu)模體。NCBI-BLAST序列比對(duì)中,LCTX-F2與穴居狼蛛（Lycosa singoriensis）轉(zhuǎn)錄... 

【文章來(lái)源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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Thrombin與抑制劑avathrin復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)及相互作用的活性部位（

狼蛛毒素LCTX-F2的表達(dá)與活性研究19（MALDI-TOF-MS）測(cè)定。（3）大量富集鑒定正確的目的峰，進(jìn)行凍干，獲得原核表達(dá)樣品。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.3.1LCTX-F2的序列分析及突變體設(shè)計(jì)蜘蛛毒液中包含多種組分，其中以富含神經(jīng)毒素的多肽和蛋白質(zhì)為主要成分。本課題組從格式狼蛛中分離到的活性成分LCTX-F2，是由65個(gè)氨基酸組成的促凝血因子活性和ASIC3通道的多肽毒素抑制劑。通過(guò)NCBI-BLAST序列比對(duì)（圖2-1），LCTX-F2與穴居狼蛛（Lycosasingoriensis）轉(zhuǎn)錄組中的多個(gè)序列具有高同源性96%，但這些序列的功能是未知的。LCTX-F2與來(lái)自狼蛛Alopecosamarikovskyi毒液中的PT2具有81.2%的同源性，PT2是一個(gè)已知P2X3受體抑制劑，但LCTX-F2不具備抑制P2X3受體的活性。在前期研究中，針對(duì)多肽毒素LCTX-F2只研究了對(duì)凝血因子和ASIC通道抑制活性的影響，其多肽毒素的活性部位及相互作用機(jī)制尚未闡明，因此本研究構(gòu)建不同的LCTX-F2突變體，研究多肽促進(jìn)凝血因子活性和抑制酸通道活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。在LCTX-F2突變體的設(shè)計(jì)上，跟從序列比對(duì)上的氨基酸差異（如7號(hào)位的精氨酸，26號(hào)位的天冬氨酸，僅在PT2毒素中出現(xiàn)），自身多肽一些帶正負(fù)電荷的氨基酸及分子對(duì)接模擬手段，一共設(shè)計(jì)了16個(gè)突變體（K2E、R7E、R15E、R20E、D10A、D10R、D14A、D14R、D26A、D26R、F31A、V41A、G35A、S43A、E54A和K61A），如圖2-2所示。圖2-1多肽毒素LCTX-F2的序列比對(duì)。注：序列分析表明F2由一個(gè)經(jīng)典的43氨基酸組成的ICK模型加一個(gè)22氨基酸組成的線性C末端，整個(gè)序列包含8個(gè)半胱氨酸。圖中灰色代表相同氨基酸，黑色代表半胱氨酸以及配對(duì)模式。

碩士學(xué)位論文20圖2-2多肽毒素LCTX-F2與突變體氨基酸序列。根據(jù)LCTX-F2構(gòu)建的16條突變體氨基酸序列，全長(zhǎng)由65個(gè)氨基酸組成，紅色標(biāo)記為該為點(diǎn)突變的氨基酸，相應(yīng)突變體的分子質(zhì)量標(biāo)記在右側(cè)。2.3.2LCTX-F2突變體的構(gòu)建利用PrimerPremier5軟件對(duì)相應(yīng)突變體進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，按照以設(shè)計(jì)好的PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件，在原始的LCTX-F2載體模板上進(jìn)行定點(diǎn)突變。擴(kuò)增完的質(zhì)粒用感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化挑取若干單克隆，測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAMAN軟件比對(duì)，如圖2-3所示，設(shè)計(jì)的突變氨基酸位點(diǎn)成功被替換成了相應(yīng)的堿基序列，初步成功構(gòu)建了16個(gè)突變載體，可用于后續(xù)的原核表達(dá)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]古老的進(jìn)化物種 奇異的蜘蛛世界[J]. 胡喜海.  中學(xué)生物學(xué). 2007(03)

博士論文
[1]作用于疼痛相關(guān)鈉通道的多肽毒素的結(jié)構(gòu)與功能研究[D]. 張凡.湖南師范大學(xué) 2015
[2]民族藥飛龍掌血止血活性成分與質(zhì)量控制方法研究[D]. 劉志剛.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 2012

碩士論文
[1]直接X(jué)a因子抑制劑TY1703抗血栓作用及機(jī)制研究[D]. 邱小妙.天津醫(yī)科大學(xué) 2019
[2]基于狼蛛轉(zhuǎn)錄組篩選的一種多肽毒素結(jié)構(gòu)和功能研究[D]. 蘇格.湖南師范大學(xué) 2018



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