N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m⁶A）是真核生物mRNA中最豐富的一種甲基化修飾。甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的存在,使得m⁶A修飾在細胞中成為一個動態(tài)可逆的過程,最終決定m⁶A修飾的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本的命運。m⁶A在基因表達調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)翻譯、細胞行為等方面起著至關(guān)重要的作用。肥胖相關(guān)蛋白（Fat mass and obesity associated protein,Fto）是一種m⁶A去甲基化酶,其在腦發(fā)育中的m⁶A去甲基化的生物學(xué)功能仍未知。因此本研究構(gòu)建了Fto基因敲除鼠（Fto-KO）,基于分析m⁶A去甲基化酶Fto的功能來探索m⁶A去甲基化在小鼠腦發(fā)育中的生物學(xué)作用。結(jié)果顯示,在小鼠出生后第14天（P14）,與野生型小鼠相比,Fto-KO鼠的體重、體長和腦組織重量均顯著性下調(diào)。其次,P14時期Fto-KO小鼠的全腦組織明顯變小,特別是小腦發(fā)生嚴重畸形。此外,小鼠腦組織冷凍切片尼氏染色結(jié)... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Ca9系統(tǒng)的作用機制CRISPR/Ca9系統(tǒng)切割DNA鏈，產(chǎn)生雙鏈DNA缺口后

22圖2.1Fto基因敲除策略首先設(shè)計合適的sgRNA靶向Fto基因的3號外顯子，然后將Cas9mRNA和sgRNA顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，通過非同源重組修復(fù)方式（NHEJ）造成Fto基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失。2、小鼠交配策略本研究是基于分析m6A去甲基化酶Fto的功能來研究m6A去甲基化對小鼠腦發(fā)育的影響，所以需要獲得一定數(shù)量的Fto純合子基因敲除鼠（基因型標(biāo)記為-/-）供后續(xù)試驗研究。小鼠交配策略如圖2.2所示。首先，將獲得的F0代Fto雜合子基因敲除鼠（基因型標(biāo)記為+/-）和野生型C57BL/6J小鼠（基因型標(biāo)記為+/+）交配，繁殖獲得一定數(shù)量的Fto雜合子基因敲除鼠。然后將獲得的Fto雜合子基因敲除鼠雌雄同籠進行繁殖，獲得目的Fto純合子基因敲除鼠進行后續(xù)實驗。同時，也獲得了更多的Fto雜合子基因敲除鼠，這一部分小鼠繼續(xù)雌雄同籠進行繁殖以獲得更多的Fto純合子基因敲除鼠。

23圖2.2Fto基因敲除鼠初步交配策略圖中白色背景的為野生型小鼠（+/+），綠色背景的為Fto雜合子基因敲除鼠（+/-），紅色背景的為Fto純合子基因敲除鼠（-/-）。2.1.2.2小鼠基因組DNA的抽提1、用酒精棉擦拭剪刀，然后剪取約3mm小鼠的尾尖放置于無菌的2mL離心管中。2、向上述離心管中加入600μL細胞裂解緩沖液（BufferSalting-out）和6μL蛋白酶K（10mg/mL），上下顛倒混勻后放置于55℃恒溫箱內(nèi)過夜消化。3、加入600μL的DNA提取液（苯酚:氯仿:異戊醇=25:24:1），充分顛倒混勻后12000rpm，離心10min。4、用200μL的移液槍緩慢地吸取適量的上清液并轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇。充分顛倒混勻后，放置于離心機中，12000rpm離心15min。5、離心完畢后，棄去上清液，并將離心管放置在通風(fēng)櫥內(nèi)使沉淀充分干燥。然后根據(jù)沉淀的大小加入50μL至200μL無菌水，充分溶解即可得到DNA溶液，然后將其放置于-20℃保存。


本文編號：3310539