豬流行性腹瀉病毒基因工程滅活疫苗的免疫試驗研究
發(fā)布時間：2021-07-23 15:51
豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是世界范圍內導致豬只產生腹瀉的主要病原體之一,尤其近十年來PEDV造成了養(yǎng)豬行業(yè)巨大的經濟損失。PEDV對各個年齡段的豬均有很高的感染率,能夠引起豬只產生腹瀉、脫水等癥狀,尤其能夠引起7日齡以下的仔豬高發(fā)病率以及高死亡率。目前對PEDV防控最有效的方式是疫苗免疫,免疫形式包括主動免疫和被動免疫。對成年豬防控PEDV的措施主要為主動免疫,對幼齡仔豬防控PEDV的方式主要為被動免疫。因此,本研究以30日齡仔豬作為研究對象,通過實驗豬的主動免疫效果來篩選重組滅活疫苗佐劑的種類,探索滅活疫苗的注射劑量;以妊娠母豬及其所產仔豬作為研究對象,初步探究PEDV 15A滅活疫苗的被動免疫效果。有效的疫苗免疫后可以誘導機體產生特異性的抗體,為能夠監(jiān)測實驗室的新型重組疫苗誘導動物機體產生特異性IgG抗體的水平,本研究首先建立了檢測PEDV IgG抗體的間接ELISA方法。以原核表達并純化的PEDV S1蛋白片段（139aa）作為包被抗原,以羊抗豬IgG-HRP作為二抗,將每步反應程序優(yōu)化并進行特異性、敏感性以及重復性試驗。特異性試驗顯示該方法對TGEV、PoRV和PDCoV常見...
【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省
【文章頁數】：64 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
PEDV模式圖和基因組結構
豬流行性腹瀉病毒基因工程滅活疫苗的免疫試驗研究18立陰性、陽性對照）37℃孵育45min，然后用PBST洗滌4次，每次洗滌后拍干，最后甩干備用。（4）二抗孵育：將酶標二抗用PBS按1：15000稀釋混勻后，每孔加入100μL稀釋二抗，37℃孵育30min，后用PBST洗滌4次，每次洗滌后拍干，最后甩干備用。（5）顯色：將商品化的TMB顯色液按照每孔100μL加入到ELISA反應板中，室溫避光顯色10min。（6）終止反應并讀數：每孔加入50μL終止液，立即用酶標儀讀取在OD450nm的值。當OD值大于0.66時判定為陽性樣品。2.3.2間接ELISA結果陰陽性臨界值的判定根據統(tǒng)計學原理，當OD450nm＞x＋3SD時，可以在99.9％的水平上判定為陽性。經計算75份陰性血清的平均值（x）為0.225，標準方差SD為0.145，根據公式：陰、陽性血清臨界值＝OD450nm平均值（x）+3×SD=0.225+3*0.145=0.66，因此，當待檢血清OD450nm≥0.66時即可判為陽性，反之判為陰性。（詳細結果見附錄表28）。2.3.3交叉性實驗按上述優(yōu)化后的間接ELISA方法對豬德爾塔冠狀病毒、豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、陽性血清進行檢測，以PEDV陰陽性血清做對照，在酶標儀OD450波長下讀出值（圖2），可以看到上述血清OD值低于陽性標準（0.66），說明以S417為包被蛋白建立的間接ELISA方法與其它病毒血清無交叉反應性。圖2交叉反應實驗結果Fig.2Cross-reactionexperimentresults
豬流行性腹瀉病毒基因工程滅活疫苗的免疫試驗研究24顯色：將商品化的TMB顯色液按照每孔100μL加入到ELISA反應板中，室溫避光顯色10min。終止反應并讀數：每孔加入50μL終止液，立即用酶標儀讀取OD450nm值。當OD值大于0.66判定為陽性樣品。3.1.3結果3.1.3.1商品化試劑盒IgG抗體水平檢測結果使用購買的商品化試劑盒對各組各時間點共計189份血清樣品進行檢測，共有5只實驗豬共計12份樣品抗體呈陽性過（試劑盒陽性判定標準S/P值＞0.35），結果見附錄表29。按組求平均值后作圖可見，在首免后，各組抗體水平都呈上升趨勢，但是只有D組抗體水平達到了陽性，C組雖然上升趨勢很明顯，但是距離陽性臨界值還有一定距離。D組15A佐劑配制的滅活苗產生了較好的主動免疫效果，抗體水平達到了一個比較高的值，并在比較高的水平下持續(xù)到8W，見圖3。圖3商品化試劑盒檢測不同佐劑組IgG抗體水平Fig.3CommercialkitswereusedtodetectIgGantibodylevelsindifferentadjuvantgroups3.1.3.2自己包被試劑盒抗體水平檢測結果使用S417試劑盒對各組各時間點共計189份血清樣品進行重復檢測，共有4只實
【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒S1蛋白B細胞表位原核表達及間接ELISA方法的建立[J]. 陳金龍,許可軍,李芬,劉通,于智慧,劉曉萌,董林,魏鳳,沈志強,許崇友,王金良. 中國獸醫(yī)學報. 2018(12)
[2]基于N蛋白的PEDV間接ELISA檢測方法的建立與初步應用[J]. 張琪,徐麗美,周宏超,楊猛超,張淼濤,于三科,許信剛. 中國獸醫(yī)科學. 2018(02)
[3]PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表達及ELISA方法的建立[J]. 鄭逢梅,趙軍,霍金耀,李歡,楊霞,陳陸,常洪濤,王新衛(wèi),劉紅英,杜季梅,姚慧霞,王川慶. 中國獸醫(yī)學報. 2014(03)
[4]基于S蛋白檢測豬流行性腹瀉抗體間接ELISA方法的建立[J]. 鄧祖麗穎. 河南農業(yè)科學. 2013(08)
[5]應用逆轉錄套式PCR檢測豬流行性腹瀉病毒[J]. 王金良,謝金文,唐娜,祖立闖,李嬌,汪洋,沈志強. 中國畜牧獸醫(yī). 2012(09)
[6]豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法建立及初步應用研究[J]. 吳學敏,陳如敬,王隆柏,車勇良,劉玉濤,莊向生,嚴山,周倫江. 中國農學通報. 2012(26)
[7]豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白與感染細胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 呂茂杰,陳建飛,時洪艷,陳小金,范秀萍,申識川,馮力. 微生物學報. 2011(05)
[8]表面表達豬流行性腹瀉病毒核蛋白蛋白的重組干酪乳桿菌誘導產生的免疫應答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經. 生物工程學報. 2009(06)
[9]豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達及其亞細胞定位的初步分析[J]. 呂茂杰,馮力,時洪艷,陳建飛,孫東波,申識川,崔小辰,王承寶,范秀萍. 畜牧獸醫(yī)學報. 2009(05)
[10]表達豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構建與鑒定[J]. 董麗娜,高鳳山,許崇波,胡桂學,姜海龍. 畜牧獸醫(yī)學報. 2008(12)
碩士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體構建及重組病毒拯救[D]. 陳冰清.東華大學 2015
本文編號：3299584
【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省
【文章頁數】：64 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
PEDV模式圖和基因組結構
豬流行性腹瀉病毒基因工程滅活疫苗的免疫試驗研究18立陰性、陽性對照）37℃孵育45min，然后用PBST洗滌4次，每次洗滌后拍干，最后甩干備用。（4）二抗孵育：將酶標二抗用PBS按1：15000稀釋混勻后，每孔加入100μL稀釋二抗，37℃孵育30min，后用PBST洗滌4次，每次洗滌后拍干，最后甩干備用。（5）顯色：將商品化的TMB顯色液按照每孔100μL加入到ELISA反應板中，室溫避光顯色10min。（6）終止反應并讀數：每孔加入50μL終止液，立即用酶標儀讀取在OD450nm的值。當OD值大于0.66時判定為陽性樣品。2.3.2間接ELISA結果陰陽性臨界值的判定根據統(tǒng)計學原理，當OD450nm＞x＋3SD時，可以在99.9％的水平上判定為陽性。經計算75份陰性血清的平均值（x）為0.225，標準方差SD為0.145，根據公式：陰、陽性血清臨界值＝OD450nm平均值（x）+3×SD=0.225+3*0.145=0.66，因此，當待檢血清OD450nm≥0.66時即可判為陽性，反之判為陰性。（詳細結果見附錄表28）。2.3.3交叉性實驗按上述優(yōu)化后的間接ELISA方法對豬德爾塔冠狀病毒、豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、陽性血清進行檢測，以PEDV陰陽性血清做對照，在酶標儀OD450波長下讀出值（圖2），可以看到上述血清OD值低于陽性標準（0.66），說明以S417為包被蛋白建立的間接ELISA方法與其它病毒血清無交叉反應性。圖2交叉反應實驗結果Fig.2Cross-reactionexperimentresults
豬流行性腹瀉病毒基因工程滅活疫苗的免疫試驗研究24顯色：將商品化的TMB顯色液按照每孔100μL加入到ELISA反應板中，室溫避光顯色10min。終止反應并讀數：每孔加入50μL終止液，立即用酶標儀讀取OD450nm值。當OD值大于0.66判定為陽性樣品。3.1.3結果3.1.3.1商品化試劑盒IgG抗體水平檢測結果使用購買的商品化試劑盒對各組各時間點共計189份血清樣品進行檢測，共有5只實驗豬共計12份樣品抗體呈陽性過（試劑盒陽性判定標準S/P值＞0.35），結果見附錄表29。按組求平均值后作圖可見，在首免后，各組抗體水平都呈上升趨勢，但是只有D組抗體水平達到了陽性，C組雖然上升趨勢很明顯，但是距離陽性臨界值還有一定距離。D組15A佐劑配制的滅活苗產生了較好的主動免疫效果，抗體水平達到了一個比較高的值，并在比較高的水平下持續(xù)到8W，見圖3。圖3商品化試劑盒檢測不同佐劑組IgG抗體水平Fig.3CommercialkitswereusedtodetectIgGantibodylevelsindifferentadjuvantgroups3.1.3.2自己包被試劑盒抗體水平檢測結果使用S417試劑盒對各組各時間點共計189份血清樣品進行重復檢測，共有4只實
【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒S1蛋白B細胞表位原核表達及間接ELISA方法的建立[J]. 陳金龍,許可軍,李芬,劉通,于智慧,劉曉萌,董林,魏鳳,沈志強,許崇友,王金良. 中國獸醫(yī)學報. 2018(12)
[2]基于N蛋白的PEDV間接ELISA檢測方法的建立與初步應用[J]. 張琪,徐麗美,周宏超,楊猛超,張淼濤,于三科,許信剛. 中國獸醫(yī)科學. 2018(02)
[3]PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表達及ELISA方法的建立[J]. 鄭逢梅,趙軍,霍金耀,李歡,楊霞,陳陸,常洪濤,王新衛(wèi),劉紅英,杜季梅,姚慧霞,王川慶. 中國獸醫(yī)學報. 2014(03)
[4]基于S蛋白檢測豬流行性腹瀉抗體間接ELISA方法的建立[J]. 鄧祖麗穎. 河南農業(yè)科學. 2013(08)
[5]應用逆轉錄套式PCR檢測豬流行性腹瀉病毒[J]. 王金良,謝金文,唐娜,祖立闖,李嬌,汪洋,沈志強. 中國畜牧獸醫(yī). 2012(09)
[6]豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法建立及初步應用研究[J]. 吳學敏,陳如敬,王隆柏,車勇良,劉玉濤,莊向生,嚴山,周倫江. 中國農學通報. 2012(26)
[7]豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白與感染細胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 呂茂杰,陳建飛,時洪艷,陳小金,范秀萍,申識川,馮力. 微生物學報. 2011(05)
[8]表面表達豬流行性腹瀉病毒核蛋白蛋白的重組干酪乳桿菌誘導產生的免疫應答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經. 生物工程學報. 2009(06)
[9]豬流行性腹瀉病毒N蛋白的真核表達及其亞細胞定位的初步分析[J]. 呂茂杰,馮力,時洪艷,陳建飛,孫東波,申識川,崔小辰,王承寶,范秀萍. 畜牧獸醫(yī)學報. 2009(05)
[10]表達豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構建與鑒定[J]. 董麗娜,高鳳山,許崇波,胡桂學,姜海龍. 畜牧獸醫(yī)學報. 2008(12)
碩士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體構建及重組病毒拯救[D]. 陳冰清.東華大學 2015
本文編號：3299584
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