發(fā)布時(shí)間：2021-07-06 13:17

　　艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性細(xì)菌。近年來(lái),大量證據(jù)表明艾克曼菌可作為一種有益細(xì)菌,在維持人體胃腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。過(guò)氧化物酶（Peroxiredoxins,Prxs）是生物體內(nèi)常見(jiàn)的硫醇特異性抗氧化蛋白,廣泛存在于多種生物體中,具有特異性強(qiáng)、分布廣、表達(dá)量高等特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物、植物、酵母、原蟲(chóng)等中Prxs結(jié)構(gòu)與功能的報(bào)道較為廣泛,關(guān)于厭氧細(xì)菌Prxs相關(guān)研究較少。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果推測(cè)艾克曼菌的Prx（AmPrx）為典型的2-Cys Prxs,此外,在序列上發(fā)現(xiàn)AmPrx比已知結(jié)構(gòu)的典型2-Cys Prxs在α4螺旋和β6折疊片之間多出一段插入。本課題為探究AmPrx的結(jié)構(gòu)與功能,通過(guò)大腸桿菌異源表達(dá)獲得AmPrx重組蛋白,使用坐滴法進(jìn)行晶體生長(zhǎng)。利用X射線衍射技術(shù)解析了AmPrx晶體結(jié)構(gòu),晶體的衍射分辨率為2.6?。同時(shí)在體外測(cè)定了AmPrx的過(guò)氧化物酶活性,并研究了AmPrx與艾克曼菌硫氧還蛋白（Akkermansia muciniphila thioredoxin,AmTrx）之間的相互作用。結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明AmPr... 

【文章來(lái)源】：安徽大學(xué)安徽省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

過(guò)氧化物酶(Prx)的反應(yīng)機(jī)理（RheeSGetal.2017）

安徽大學(xué)碩士學(xué)位論文7圖1.2AmPrx與其他典型2-CysPrxs的序列比對(duì)Figure1.2SequencealignmentofAmPrxagainstothertypical2-CysPrxsfromdifferentorganisms.AmPrx的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示在序列的上方。CP和CR用黑色箭頭表示。比對(duì)的序列分別為:AkkermansiaglycaniphilaPrx,Haloferulasp.BvORR071Prx,RubritaleamarinaPrx,BacteroidesgraminisolvensPrx,MarinifilumflexuosumPrx,HomosapiensPrx1,HomosapiensPrx2,HomosapiensPrx3,HomosapiensPrx4,MusMusculusPrx4,ArabidopsisthalianaPrxA,andHookwormAncylostomaPrx1.

第二章實(shí)驗(yàn)材料與方法20○8測(cè)各孔在560nm處的吸光值，○6-○8步驟重復(fù)3次，計(jì)算同樣編號(hào)三孔的平均值�！�9繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2.1）。圖2.1H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure2.1StandardcurveofH2O2concentration2.2.8AmPrx過(guò)氧化物酶活性測(cè)定根據(jù)酶活測(cè)定的原理，本實(shí)驗(yàn)用H2O2定量分析試劑盒測(cè)定AmPrx蛋白酶活性。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先配置反應(yīng)體系所用的緩沖液（20mMTris-HCl,pH7.5,300mMNaCl,5%glycerol），再向反應(yīng)體系中加入0.5mMDTT、6μMAmTrx蛋白,以及4μMAmPrx及其突變體蛋白(AmPrxC49S,AmPrxS80E,AmPrx△120-132)。然后25℃恒溫孵育10min后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制檢測(cè)液，配好后，按照每孔200μl的體積加入96孔酶標(biāo)板，孵育10min后向體系中加入90μMH2O2，然后分別在反應(yīng)1、2、3、4、5min時(shí)取10μl的反應(yīng)液加入96孔板中的H2O2定量分析試劑盒檢測(cè)液中（此過(guò)程重復(fù)3次），混勻20min后立即放入酶標(biāo)儀選擇波長(zhǎng)560nm并讀數(shù)，根據(jù)讀數(shù)計(jì)算H2O2的消耗量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。2.2.9圓二色光譜實(shí)驗(yàn)圓二色光譜（CD譜）可以檢測(cè)溶液狀態(tài)下蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是目前測(cè)定蛋白質(zhì)二

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Gut microbiota role in irritable bowel syndrome: New therapeutic strategies[J]. Eleonora Distrutti,Lorenzo Monaldi,Patrizia Ricci,Stefano Fiorucci.  World Journal of Gastroenterology. 2016(07)



本文編號(hào)：3268314