熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）是目前自然界中已知的降解木質(zhì)纖維素最高效的微生物之一,是利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物能源和化學(xué)品的理想菌株。熱纖梭菌擁有高效的多酶復(fù)合體稱為纖維小體,可以將植物細(xì)胞壁中的多糖分解成可溶性的糖。已有的研究發(fā)現(xiàn),熱纖梭菌纖維小體的組成受到細(xì)胞外底物種類的調(diào)控,其調(diào)控機(jī)制可能是通過多個(gè)sigma和anti-sigma因子對來完成的。了解sigma-anti-sigma因子之間的信號傳導(dǎo)機(jī)制,有助與對纖維小體進(jìn)行定向改造,開發(fā)高效降解木質(zhì)纖維素的體系。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和跨膜預(yù)測分析表明,調(diào)控纖維小體表達(dá)的anti-sigma因子是跨膜蛋白,具有一個(gè)胞外的多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域,一個(gè)跨細(xì)胞壁的無序區(qū),一個(gè)周質(zhì)空間結(jié)構(gòu)域,一個(gè)跨膜螺旋和一個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。本文選擇了熱纖梭菌ATCC 27405中Cthe₀267編碼的anti-sigma因子RsgI2作為研究對象,綜合利用了分子生物學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)生化技術(shù)及核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）技術(shù)對RsgI2進(jìn)行了以下研究：（1）熱纖梭菌anti-sig... 

【文章來源】：中國海洋大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

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摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 纖維小體
        1.1.1 腳架蛋白
        1.1.2 Cohesin和dockerin模塊
        1.1.3 酶亞基
        1.1.4 纖維小體的多樣性
    1.2 ECF sigma因子的研究進(jìn)展
        1.2.1 ECF sigma因子屬于σ~(70)家族
        1.2.2 ECF sigma因子的作用
        1.2.3 ECF sigma因子的特點(diǎn)
        1.2.4 ECF sigma因子的信號傳導(dǎo)機(jī)制
    1.3 熱纖梭菌中sigma-anti-sigma因子的研究進(jìn)展
        1.3.1 熱纖梭菌中sigma-anti-sigma因子的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 sigma因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.3.3 anti-sigma因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.3.4 anti-sigma因子對胞外多糖的特異性識別
        1.3.5 anti-sigma與sigma因子的特異性相互作用
        1.3.6 sigma因子和纖維小體基因表達(dá)的相關(guān)性
        1.3.7 已有的anti-sigma-sigma因子的調(diào)控模型
    1.4 蛋白純化遇到的常見問題
        1.4.1 蛋白的穩(wěn)定性
        1.4.2 蛋白的表達(dá)量
        1.4.3 蛋白純化方法的選擇
    1.5 蛋白結(jié)構(gòu)解析的常用方法
    1.6 課題研究內(nèi)容與意義
第二章 熱纖梭菌RsgI2胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域重組載體的克隆、表達(dá)純化及NMR結(jié)構(gòu)分析
    2.1 熱纖梭菌anti-sigma因子的選擇
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 質(zhì)粒與菌株
        2.2.2 分子生物學(xué)相關(guān)試劑
        2.2.3 主要儀器一覽表(表2-1)
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 構(gòu)建含單一目的基因的重組載體
            1) 目的片段的獲得
            2) 載體和目的基因雙酶切
            3) 載體和目的片段連接
            4) 轉(zhuǎn)化克隆菌株DH5α
            5) 陽性克隆篩選與測序驗(yàn)證
            6) 轉(zhuǎn)化菌株BL21
        2.3.2 重組載體的表達(dá)與優(yōu)化
        2.3.3 對已構(gòu)建的載體進(jìn)行點(diǎn)突變
        2.3.4 蛋白純化方法
        2.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳方法
        2.3.6 濃縮管的使用
        2.3.7 NMR樣品的制備
        2.3.8 NMR滴定實(shí)驗(yàn)
        2.3.9 數(shù)據(jù)的處理、分析及結(jié)構(gòu)計(jì)算
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果矛口討論
        2.4.1 RsgI2-ND的表達(dá)純化
            1) RsgI2-ND的預(yù)表達(dá)
            2) RsgI2-ND的表達(dá)純化
            3) 初步的NMR分析
            4) RsgI-ND突變體的表達(dá)純化
        2.4.2 化學(xué)位移指認(rèn)
        2.4.3 RsgI2-ND(L23D)的結(jié)構(gòu)解析
        2.4.4 RsgI2-ND(L23D)與單糖、二糖的作用
    2.5 本章小結(jié)
第三章 熱纖梭菌RsgI2周質(zhì)空間結(jié)構(gòu)域重組載體的克隆、表達(dá)純化及NMR結(jié)構(gòu)分析
    3.1 Cthe 0267編碼的anti-sigma因子存在周質(zhì)空間結(jié)構(gòu)域
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 構(gòu)建含單一目的基因的重組載體
        3.2.2 重組載體的表達(dá)與優(yōu)化
        3.2.3 蛋白純化方法
        3.2.4 NMR樣品的制備
        3.2.5 數(shù)據(jù)的處理、分析和結(jié)構(gòu)計(jì)算
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.3.1 RsgI2-PD表達(dá)載體的表達(dá)純化
            1) RsgI2-PD-30a(86-259)的表達(dá)純化
            2) RsgI2-PD-SMT(86-259)的表達(dá)純化
            3) RsgI2-PD-30a(86-259)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
            4) 截取不同長度的RsgI2-PD
            5) RsgI2-PD-30a(89-248)的表達(dá)優(yōu)化
            6) RsgI2-PD-30a(89-248)的表達(dá)純化
        3.3.2 化學(xué)位移指認(rèn)
        3.3.3 RsgI2-PD-30a(89-248)的結(jié)構(gòu)解析
    3.4 本章小結(jié)
第四章 Sigma-anti-sigma因子信號傳導(dǎo)機(jī)制的初步研究
    4.1 熱纖梭菌sigma的選擇
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 構(gòu)建含單一目的基因的重組載體
        4.2.2 重組載體的表達(dá)與優(yōu)化
        4.2.3 蛋白純化方法
        4.2.4 蛋白與啟動(dòng)子之間的EMSA實(shí)驗(yàn)
        4.2.5 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
        4.2.6 凝膠過濾層析技術(shù)
        4.2.7 NMR滴定實(shí)驗(yàn)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        4.3.1 SigI2的表達(dá)純化
        4.3.2 啟動(dòng)子識別機(jī)制
        4.3.3 sigma-anti-sigma識別機(jī)制
            1) 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)蛋白間的相互作用
            2) 凝膠過濾層析技術(shù)檢驗(yàn)蛋白間的相互作用
            3) NMR滴定實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)蛋白間的相互作用
    4.4 本章小結(jié)
第五章 論文總結(jié)和展望
    5.1 總結(jié)
        5.1.1 熱纖梭菌RsgI2胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)純化及NMR結(jié)構(gòu)分析
        5.1.2 熱纖梭菌RsgI2周質(zhì)空間結(jié)構(gòu)域的表達(dá)純化及NMR結(jié)構(gòu)分析
        5.1.3 Sigma-anti-sigma因子信號傳導(dǎo)機(jī)制的初步研究
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
個(gè)人簡歷
發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]降解纖維素的“超分子機(jī)器”研究進(jìn)展[J]. 王金蘭,王祿山,劉巍峰,陳冠軍,高培基.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2011(01)



本文編號：3194339