NCD偏好性的突變型FNR的篩選及其性能研究
發(fā)布時(shí)間：2021-04-01 19:16
光自養(yǎng)生物光系統(tǒng)末端的鐵氧還蛋白-NADP還原酶（FNR）,利用光合作用產(chǎn)生的電子再生NADPH,為生物合成提供還原力。但NADPH作為天然輔酶,參與眾多胞內(nèi)代謝途徑,無(wú)法選擇性地將還原力傳遞到目標(biāo)途徑,降低了還原力利用效率及可控性。人工輔酶煙酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）具有NAD（P）的還原力傳遞能力,同時(shí)不被天然代謝途徑識(shí)別,可降低代謝系統(tǒng)復(fù)雜性,將還原力特異性地傳遞給目標(biāo)途徑。本論文結(jié)合FNR結(jié)構(gòu)分析、高通量篩選方法設(shè)計(jì),通過(guò)蛋白定向進(jìn)化策略對(duì),Synechocystis sp.PCC 6803來(lái)源的FNR進(jìn)行突變改造,篩選具有NCD偏好性的FNR突變型,利用光合作用產(chǎn)生的還原力再生NCDH,以實(shí)現(xiàn)還原力的選擇性傳遞。同時(shí)針對(duì)NCD無(wú)法胞內(nèi)合成且跨膜運(yùn)輸效率低的問(wèn)題,建立高效NCD轉(zhuǎn)運(yùn)策略。取得主要成果如下:建立基于輔酶循環(huán)顯色的高通量活性檢測(cè)方法以及基于HpaB-FNR融合蛋白的平板顯色高通量篩選策略。通過(guò)模擬及分析FNR結(jié)構(gòu),確定了 10個(gè)可能影響FNR輔酶偏好性的活性位點(diǎn)。建立對(duì)應(yīng)的單位點(diǎn)飽和突變文庫(kù)、雙位點(diǎn)飽和突變文庫(kù)與隨機(jī)突變文庫(kù)。篩選了4個(gè)單位點(diǎn)飽和突變文庫(kù)、9個(gè)雙位...
【文章來(lái)源】：東北電力大學(xué)吉林省
【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
圖１－１?ＮＡＤ與ＮＣＤ結(jié)構(gòu)示意圖??
５，還原生成ＦＡＤＨ２，而??后通過(guò)氧化ＦＡＤＨ２，將還原力進(jìn)一步傳遞給ＮＡＤＰ，生成ＮＡＤＰＨ［２６］。相關(guān)研宄表明，ＦＮＲ??不單單參與ＮＡＤＰＨ的再生，還參與了光合作用ＰＳＩ中的電子循環(huán)流動(dòng)。這種電子流動(dòng)的??轉(zhuǎn)移，不會(huì)生成ＮＡＤＰＨ，但會(huì)促進(jìn)ＡＴＰ的合成。研宄者認(rèn)為，ＦＮＲ?—定程度上促進(jìn)了??ＡＴＰ的積累，為植物固定Ｃ〇２提供了能量。??ＮＡＤＰ＊?－Ｈ?Ｚ?目??ｋＮＡＤＰＨ〈??＼餘錄??ｌ．祕(mì)錄????—：：：：二：二心一＿＿———?ＡＴＰ??圖１－２光電子傳遞示意圖??１．４．?２?ＦＮＲ的應(yīng)用??ＦＮＲ可利用光合作用產(chǎn)生的還原力，還原再生ＮＡＤＰＨ，因此，對(duì)ＦＮＲ的相關(guān)研究主??要集中在強(qiáng)化光合作用效率這一方面。Ｌｕｏ等人通過(guò)構(gòu)建ＦＮＲ的表達(dá)載體，于辦??ｓｐ．?ＰＣＣ?６８０３體內(nèi)過(guò)表達(dá)ＦＮＲ蛋白，強(qiáng)化ＮＡＤＰＨ的合成，使ＮＡＤＰＨ濃度提高了?８０．８％［２７］。??Ｄｉａｋｏｎｏｖａ等人通過(guò)研宄ＦＮＲ與Ｆｄ相互間的靜電作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)ｐＨ由６增加到８時(shí)，ＦＮＲ??與Ｆｄ之間的電子傳遞速率提高了?３倍，提高了胞內(nèi)ＮＡＤＰＨ的合成ｆ２８ｌ?Ｙｕ等人通過(guò)在真??核藻類體內(nèi)表達(dá)異源ＦＮＲ，研究高鹽脅迫條件下ＦＮＲ與電子傳遞的聯(lián)系與調(diào)控機(jī)制，該??研究為強(qiáng)化ＮＡＤＰＨ的還原再生提供了理論基礎(chǔ)［２９］。利用ＦＮＲ催化輔酶再生的性質(zhì)，可??用于異源代謝途徑的輔酶調(diào)控。ＫｙＨａｋａｋｉｓ等人基于ＦＮＲ介導(dǎo)Ｆｄ與ＮＡＤＰ氧化還原的特??性，利用ＦＮＲ構(gòu)建輔酶循環(huán)，成功建立異源代謝體系＠１。蛋白的結(jié)構(gòu)特征決定其功能，??加強(qiáng)對(duì)ＦＮＲ蛋白結(jié)構(gòu)的研究，有助于強(qiáng)化光合作用。Ｇｒｚｙｂ等人使用大腸桿菌表達(dá)?
第２章實(shí)驗(yàn)材料與方法??３５??３０?＿??Ｉ＂：??９?ｙ＝１．５２６５ｘ??ｇ?１０?■?Ｒ２?＝?０?？卿?２??５??０?ｉ＾－?．?．???，??０?５?１０?１５?２０??ＡＡ＾７＾ｍｉｎ??圖２－１?ＮＡＤ標(biāo)準(zhǔn)曲線??８??Ｊ－??？Ｓ?５?ｙ?＝?６．７５９９ｘ?＋０．６２２３??Ｍ?Ｒ２?＝?０．９９３５??Ｃ，＾??０?０２?０．４?０．６?０．８?１?１２??ＡＡｊ７〇ｎｉｉｎ??圖２－２ＮＣＤ標(biāo)準(zhǔn)曲線??－２３－??
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]工業(yè)微生物中NADH的代謝調(diào)控[J]. 秦義,董志姚,劉立明,陳堅(jiān). 生物工程學(xué)報(bào). 2009(02)
[2]細(xì)胞透性化技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 周帥,王鳳山. 生命的化學(xué). 2008(04)
本文編號(hào)：3113846
【文章來(lái)源】：東北電力大學(xué)吉林省
【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
圖１－１?ＮＡＤ與ＮＣＤ結(jié)構(gòu)示意圖??
５，還原生成ＦＡＤＨ２，而??后通過(guò)氧化ＦＡＤＨ２，將還原力進(jìn)一步傳遞給ＮＡＤＰ，生成ＮＡＤＰＨ［２６］。相關(guān)研宄表明，ＦＮＲ??不單單參與ＮＡＤＰＨ的再生，還參與了光合作用ＰＳＩ中的電子循環(huán)流動(dòng)。這種電子流動(dòng)的??轉(zhuǎn)移，不會(huì)生成ＮＡＤＰＨ，但會(huì)促進(jìn)ＡＴＰ的合成。研宄者認(rèn)為，ＦＮＲ?—定程度上促進(jìn)了??ＡＴＰ的積累，為植物固定Ｃ〇２提供了能量。??ＮＡＤＰ＊?－Ｈ?Ｚ?目??ｋＮＡＤＰＨ〈??＼餘錄??ｌ．祕(mì)錄????—：：：：二：二心一＿＿———?ＡＴＰ??圖１－２光電子傳遞示意圖??１．４．?２?ＦＮＲ的應(yīng)用??ＦＮＲ可利用光合作用產(chǎn)生的還原力，還原再生ＮＡＤＰＨ，因此，對(duì)ＦＮＲ的相關(guān)研究主??要集中在強(qiáng)化光合作用效率這一方面。Ｌｕｏ等人通過(guò)構(gòu)建ＦＮＲ的表達(dá)載體，于辦??ｓｐ．?ＰＣＣ?６８０３體內(nèi)過(guò)表達(dá)ＦＮＲ蛋白，強(qiáng)化ＮＡＤＰＨ的合成，使ＮＡＤＰＨ濃度提高了?８０．８％［２７］。??Ｄｉａｋｏｎｏｖａ等人通過(guò)研宄ＦＮＲ與Ｆｄ相互間的靜電作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)ｐＨ由６增加到８時(shí)，ＦＮＲ??與Ｆｄ之間的電子傳遞速率提高了?３倍，提高了胞內(nèi)ＮＡＤＰＨ的合成ｆ２８ｌ?Ｙｕ等人通過(guò)在真??核藻類體內(nèi)表達(dá)異源ＦＮＲ，研究高鹽脅迫條件下ＦＮＲ與電子傳遞的聯(lián)系與調(diào)控機(jī)制，該??研究為強(qiáng)化ＮＡＤＰＨ的還原再生提供了理論基礎(chǔ)［２９］。利用ＦＮＲ催化輔酶再生的性質(zhì)，可??用于異源代謝途徑的輔酶調(diào)控。ＫｙＨａｋａｋｉｓ等人基于ＦＮＲ介導(dǎo)Ｆｄ與ＮＡＤＰ氧化還原的特??性，利用ＦＮＲ構(gòu)建輔酶循環(huán)，成功建立異源代謝體系＠１。蛋白的結(jié)構(gòu)特征決定其功能，??加強(qiáng)對(duì)ＦＮＲ蛋白結(jié)構(gòu)的研究，有助于強(qiáng)化光合作用。Ｇｒｚｙｂ等人使用大腸桿菌表達(dá)?
第２章實(shí)驗(yàn)材料與方法??３５??３０?＿??Ｉ＂：??９?ｙ＝１．５２６５ｘ??ｇ?１０?■?Ｒ２?＝?０?？卿?２??５??０?ｉ＾－?．?．???，??０?５?１０?１５?２０??ＡＡ＾７＾ｍｉｎ??圖２－１?ＮＡＤ標(biāo)準(zhǔn)曲線??８??Ｊ－??？Ｓ?５?ｙ?＝?６．７５９９ｘ?＋０．６２２３??Ｍ?Ｒ２?＝?０．９９３５??Ｃ，＾??０?０２?０．４?０．６?０．８?１?１２??ＡＡｊ７〇ｎｉｉｎ??圖２－２ＮＣＤ標(biāo)準(zhǔn)曲線??－２３－??
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]工業(yè)微生物中NADH的代謝調(diào)控[J]. 秦義,董志姚,劉立明,陳堅(jiān). 生物工程學(xué)報(bào). 2009(02)
[2]細(xì)胞透性化技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 周帥,王鳳山. 生命的化學(xué). 2008(04)
本文編號(hào)：3113846
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