梭菌病是由梭菌屬（Clostridium）中致病性菌種引起的疾病的總稱。通常包括產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、破傷風(fēng)梭菌等。其中對于我國威脅最大的便是產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌。梭菌病發(fā)病急促,病程短,死亡率高。動物一旦發(fā)病往往來不及治療便發(fā)生死亡。因而免疫接種是預(yù)防本病的最為直接有效的方法。目前國內(nèi)的三聯(lián)四防疫苗其主要抗原成分多為菌體或類毒素,而腐敗梭菌作為一種嚴格厭氧菌,本身的培養(yǎng)難度大,產(chǎn)毒能力弱,使得疫苗的防護能力大打折扣。通過基因工程表達的重組腐敗梭菌α毒素可以保留天然毒素的免疫原性,同時生產(chǎn)工藝簡單,可以用于三聯(lián)四防疫苗的升級換代。因此,本研究擬制備C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和重組腐敗梭菌α毒素二價二聯(lián)疫苗。在本研究中,對C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCTC 3180）和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCTC 8346）進行復(fù)蘇、增菌和產(chǎn)毒。利用一次性細菌濾器過濾除菌獲得毒素溶液。并利用本實驗室構(gòu)建完成的表達重組腐敗梭菌α毒素的質(zhì)粒通過原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白。將C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素和重組腐敗梭菌α毒素按一定比例混合后經(jīng)過甲醛滅活后,加入白油佐劑制得二聯(lián)二價疫苗。對制備的疫苗進行物理性狀檢查、無菌... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

細菌革蘭氏染色鏡檢圖（A：C型產(chǎn)氣莢膜梭菌染色菌染色鏡檢圖）

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文253.結(jié)果3.1毒素的制備3.1.1C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌的復(fù)蘇將C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCTC3180）、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCTC8346）和腐敗梭菌（ATCC12464）等菌種進行復(fù)蘇后，將其接種在增菌培養(yǎng)基，并進行革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)。圖1A和圖1B中菌體呈現(xiàn)典型的革蘭氏陽性桿菌，兩端鈍圓，邊緣筆直，部分菌體成對出現(xiàn)。符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的形態(tài)。而在圖1C中，細菌呈革蘭氏陽性，菌體為絲狀聚集在一起，具有明顯的腐敗梭菌形態(tài)特征。上述結(jié)果初步證明細菌增殖成功。3.1.2C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌的PCR鑒定復(fù)蘇成功且大量增菌的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌通過煮沸使菌體破裂提取細菌的DNA，并用相應(yīng)的鑒定引物進行PCR擴增和凝膠電泳的鑒定分析。結(jié)果如圖2所示，成功克隆出C型產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性基因（85bp），D型產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性基因（697bp），在圖3中成功克隆腐敗梭菌特異性基因（208bp），測序結(jié)果正確。圖1細菌革蘭氏染色鏡檢圖（A：C型產(chǎn)氣莢膜梭菌染色鏡檢圖；B：D型產(chǎn)氣莢膜梭菌染色鏡檢圖；C：腐敗梭菌染色鏡檢圖）Fig.1microscopicexaminationofGramstainingofbacteria(A:microscopicexaminationofClostridiumperfringenstypeC;B:microscopicexaminationofClostridiumperfringenstypeD;C:microscopicexaminationofClostridiumsepticum)ABC

C、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素和重組腐敗梭菌α毒素二價二聯(lián)疫苗的制備及免疫效果的評價26bpM1234567891011123.1.3表達重組腐敗梭菌α毒素陽性克隆菌株的篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化完成后，隨機在LB培養(yǎng)基上挑取單個菌落（圖4），經(jīng)過增菌培養(yǎng)后，選取數(shù)株增菌效果良好的菌株進行PCR鑒定和測序分析，用于陽性菌株的篩眩PCR鑒定結(jié)果如圖5所示，在1500bp左右可見明顯條帶，符合預(yù)期。送檢測序結(jié)果正確。說明所選取的菌株均為陽性克隆菌株，可用于重組腐敗梭菌α毒素蛋白的表達。bpM1234567圖2細菌PCR鑒定電泳圖（M：Maker；1-5：C型產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性基因片段；6：陰性對照；7-11：D型產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性基因片段；12：陰性對照）Figure2ElectrophoresisimagesofbacterialPCRidentification(M:Maker;1-5:Clostridiumperfringens-specificgenefragments;6:negativecontrol;7-11:Clostridiumperfringens-specificgenefragments;12:negativecontrol)圖3腐敗梭菌鑒定電泳圖（M：Maker；1：腐敗梭菌特異性基因片段；2：陰性對照）Figure3ElectrophoresisofClostridiumsepticumidentification(M:Maker;1:Clostridiumsepticum-specificgenefragment;2:Negativecontrol)圖4：轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上生長Figure4:TransformedE.coligrowsonLBmedium50003000200010007505002501001500bp圖5陽性克隆株P(guān)CR擴增產(chǎn)物電泳圖（M：Maker；1-6：待檢菌液；7：陰性對照）Figure5ElectrophoresismapofPCRamplificationproductsofpositiveclones(M:Maker;1-6:bacterialsolutiontobetested;7:negativecontrol)20001000750500250100bpM1220001000750500250100

【參考文獻】：
期刊論文
[1]新西蘭兔產(chǎn)氣莢膜梭菌性腹瀉引起的臟器損傷和腸道菌群分析[J]. 陳端端,劉偉,孟德志,許文萍,楊玲玲,柴同杰,王海榮.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2019(12)
[2]產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素突變體的表達及免疫保護力評價[J]. 杜吉革,薛麒,朱真,李啟紅,印春生,姚文生,康凱,陳小云.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2019(02)
[3]產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素cpe陽性雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立及應(yīng)用[J]. 張蓉蓉,張騰飛,艾地云,羅青平,溫國元,王紅琳,邵華斌.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2017(01)
[4]綿羊腐敗梭菌病的病原診斷[J]. 尹相虎,李生慶,李志寧,范玉霞.  中國獸醫(yī)雜志. 2015(09)
[5]產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 孫佳芝,王新桐,劉雪慧,苗增民,劉志浩,王海榮,柴同杰.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2014(06)
[6]青島地區(qū)規(guī)�；脠霎a(chǎn)氣莢膜梭菌流行株毒素型、遺傳多樣性和耐藥性研究[J]. 呂長輝,王方山,孫佳芝,郝海玉,劉雪慧,李超,王海榮.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2014(02)
[7]產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素突變基因的表達及其抗體中和效價測定[J]. 王超,唐麗杰,葛俊偉,喬薪媛,崔文,姜艷萍,李一經(jīng).  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2013(06)
[8]梅花鹿腐敗梭菌病的診斷[J]. 李生慶,張西云,范玉霞,李秀萍,胡國元,劉生財,王亭亭.  畜牧與獸醫(yī). 2011(05)
[9]A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α-毒素生產(chǎn)發(fā)酵工藝[J]. 呂靜,柴同杰,張興曉,王炳曉.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2010(01)
[10]一起獺兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診治[J]. 楊玉芝.  中國養(yǎng)兔雜志. 2008(08)

碩士論文
[1]腐敗梭菌α毒素單抗、多抗的制備及DAS-ELISA方法的初步建立[D]. 林靜.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
[2]E型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗與抗毒素血清的研制[D]. 馬連營.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[3]鴨坦布蘇病毒、鴨源大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌三聯(lián)苗的研制[D]. 劉曉文.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素免疫組化檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 秦貴平.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[5]A型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗的臨床應(yīng)用和保護效果評價[D]. 林曉佳.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[6]C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗與抗毒素血清的制備研究[D]. 樊金.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015



本文編號：3026223