水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）與狂犬病毒都屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）,且該病毒為水皰病毒屬（Vesiculvirus）的原型。部分家畜如豬、牛、馬在感染了水皰性口炎病毒后,其臨床表現(xiàn)癥狀與口蹄疫和豬水皰疹極為相似,均有舌、唇、乳頭等部位出現(xiàn)水皰和潰爛的癥狀,因此該病在獸醫(yī)臨床診斷上也極易出現(xiàn)誤診。并且該病為人獸共患性傳染病,人類對(duì)此病毒易感,直接接觸與氣溶膠都是該病的傳播方式,其臨床表現(xiàn)為頭疼、發(fā)熱、惡心、無(wú)力等類似流感樣的癥狀。目前對(duì)水皰性口炎還沒(méi)有有效且可靠的治療方法,因此對(duì)該病的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。由水皰性口炎病毒感染引起的水皰性口炎雖然對(duì)畜群的致死率不高,但是對(duì)畜群個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育造成的影響嚴(yán)重,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)所造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。該病在各個(gè)國(guó)家都有發(fā)生,并且被包括美國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家列為必須上報(bào)的重點(diǎn)動(dòng)物疫病,我國(guó)在2012-2020年國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防止規(guī)劃中將水皰性口炎列為13種重點(diǎn)防范的動(dòng)物外來(lái)疫病之一。DNA甲基化是目前研究的最為成熟的一種表觀遺傳修飾,在調(diào)控基因表達(dá),維持染色體構(gòu)象等方面起著至關(guān)重要... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

VSV對(duì)細(xì)胞內(nèi)D

第二篇實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第一章DNMT1影響VSV的感染和復(fù)制16達(dá)量最高，然而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞接種VSV后2、4、8h后，細(xì)胞內(nèi)Dnmt1基因轉(zhuǎn)錄水平明顯呈下降趨勢(shì)。如圖1.1。AB圖1.1VSV對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNMT1基因表達(dá)的影響圖1.1A.以MOI=1對(duì)RAW264.7細(xì)胞接種VSV，WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)6和12h后DNMT1蛋白表達(dá)量；B.RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞在接毒后2、4、8h后，細(xì)胞內(nèi)Dnmt1的轉(zhuǎn)錄水平變化。1.3.2RAW264.7細(xì)胞中Dnmt1基因沉默應(yīng)用慢病毒包裝技術(shù)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)Dnmt1基因進(jìn)行沉默處理，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Dnmt1的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)比正常細(xì)胞下降了近80%；同時(shí)WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNMT1蛋白的表達(dá)量遠(yuǎn)低于正常細(xì)胞。如圖1.2。AB圖1.2RAW264.7細(xì)胞中Dnmt1基因沉默結(jié)果圖1.2A.RT-qPCR檢測(cè)RAW細(xì)胞與構(gòu)建的細(xì)胞系RAW-△DNMT1中Dnmt1基因的轉(zhuǎn)錄水平；B.WesternBlot檢測(cè)RAW細(xì)胞與RAW-△DNMT1細(xì)胞系內(nèi)DNMT1蛋白表達(dá)量。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

第二篇實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第一章DNMT1影響VSV的感染和復(fù)制18E圖1.3基因和蛋白水平阻斷DNMT1對(duì)VSV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖的影響圖1.3A.RT-qPCR檢測(cè)檢測(cè)Thioguanine處理RAW264.7細(xì)胞后，以MOI=1接種VSV，細(xì)胞內(nèi)病毒P基因表達(dá)水平；B.TCID50實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Thioguanine處理RAW264.7細(xì)胞，以MOI=1接種VSV后，細(xì)胞上清液中VSV的滴度；C.以MOI=1向RAW和RAW-△DNMT1細(xì)胞中接種VSV后，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒P基因的表達(dá)水平；D.TCID50檢測(cè)RAW與RAW-△DNMT1細(xì)胞上清液中VSV的滴度；E.WseternBlot檢測(cè)RAW和RAW-△DNMT1細(xì)胞中病毒G蛋白的含量。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。1.4討論病毒在感染細(xì)胞的過(guò)程中可先后調(diào)控多種表觀遺傳因子的表達(dá)，從而達(dá)到可對(duì)細(xì)胞持續(xù)感染的目的[100-101]。而本實(shí)驗(yàn)中，在RAW264.7細(xì)胞感染VSV后，細(xì)胞內(nèi)的DNMT1的含量在前12h內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的升高現(xiàn)象，而感染24h時(shí)細(xì)胞內(nèi)DNMT1的含量相比12h時(shí)顯著降低，這可能是因?yàn)榧?xì)胞的活力受到了病毒的破壞所導(dǎo)致，有待進(jìn)一步研究。同樣實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果中，細(xì)胞在接毒8h內(nèi)，Dnmt1基因的表達(dá)量則成下降趨勢(shì)。也就是說(shuō)VSV感染細(xì)胞后Dnmt1基因的表達(dá)確實(shí)受到了病毒的調(diào)控，這個(gè)結(jié)果與之前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的結(jié)果一致。作為重要的表觀遺傳因子，Dnmt1基因的表達(dá)受到VSV的影響，同樣在藥物學(xué)失活DNMT1蛋白實(shí)驗(yàn)中，硫鳥嘌呤作為DNMT1的抑制劑，不僅可以阻斷DNMT1的功能，同時(shí)還可以降解DNMT1。在硫鳥嘌呤處理細(xì)胞后，VSV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增殖水平受到了顯著的抑制而明顯低于正常細(xì)胞組，這說(shuō)明DNMT1蛋白的失活顯著影響了VSV的復(fù)制增殖。而應(yīng)用慢病毒包裝技術(shù)對(duì)細(xì)

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：2992370