角蛋白是一種外胚層結(jié)構(gòu)蛋白,是硬蛋白家族成員之一。據(jù)報道,角蛋白對生殖過程特別是對早期胚胎發(fā)育起著至關(guān)重要的作用,被作為滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞的標(biāo)記物。目前有關(guān)角蛋白的研究甚少,已知的角蛋白主要在表皮細(xì)胞以及簡單上皮細(xì)胞中表達(dá),具有高度的上皮細(xì)胞類型和組織分化的特異性。其中細(xì)胞角蛋白18（KRT18）屬于Ⅰ型（等電點為4.9-5.4）酸性角蛋白,不僅在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)以及細(xì)胞的完整性與功能性方面有著重要的作用,而且在細(xì)胞周期、胞內(nèi)信號通路、細(xì)胞凋亡、有絲分裂、早期胚胎著床等細(xì)胞內(nèi)生理過程中也發(fā)揮著重要的作用。本研究針對牛角蛋白18（KRT18）基因設(shè)計并構(gòu)建了 CRISPR/Cas9表達(dá)載體,稱為Cas9/gRNA。實驗選用的質(zhì)粒載體具有新霉素抗性基因（Neor）,通過對基礎(chǔ)框架載體進(jìn)行去除CAG啟動子的改造（命名為pGlrkt-2）和KRT18基因5’及3’同源臂的插入,構(gòu)建了針對CRISPR/Cas9切割位點的同源打靶載體,并命名為pKlrkt.其外源基因為人源化的EGFP,在EGFP上游包含長995bp的5’同源臂,在pKlrkt表達(dá)框架下游包含長946bp的3’同源臂。經(jīng)限制性酶切片... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一部分 實驗研究
    第一章 pKlrkt打靶載體的構(gòu)建
        前言
        1 試劑和設(shè)備
            1.1 實驗試劑和材料
            1.2 儀器和設(shè)備
        2 方法
            2.1 牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組DNA的提取
            2.2 角蛋白18 （KRT18）基因同源臂的獲取
            2.3 同源臂的PCR擴(kuò)增鑒定和一代基因測序比對分析
            2.4 基礎(chǔ)載體pGlrkt-1去除CAG啟動子改造
            2.5 3'同源臂連入基礎(chǔ)載體
            2.6 5'同源臂連入基礎(chǔ)載體
            2.7 pKlrkt基礎(chǔ)載體的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 基礎(chǔ)載體pGlrkt-1去除啟動子的結(jié)果
            3.2 同源臂擴(kuò)增結(jié)果
            3.3 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
            3.4 pKlrkt載體鑒定結(jié)果
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
    第二章 CRISPR/Cas9介導(dǎo)GFP基因在牛KRT18位點的定點整合
        前言
        1 試劑和設(shè)備
            1.1 實驗試劑和材料
            1.2 儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
            2.2 打靶細(xì)胞的制備和篩選
            2.3 基因組的提取
                2.3.1 細(xì)胞裂解液的配制[21]:
                2.3.2 基因組的提取
            2.4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 電轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
            3.2 同源臂RT-PCR鑒定結(jié)果
        4 討論
        5 結(jié)論
        參考文獻(xiàn)
    實驗總結(jié)
第二部分 文獻(xiàn)綜述 KRT18蛋白研究進(jìn)展
    前言
    1 角蛋白18 （KRT18）的功能特點
    2 角蛋白18（KRT18）的調(diào)節(jié)機(jī)理
        2.1 角蛋白18 （KRT18）發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)理的功能
        2.2 早期胚胎中牛和小鼠KRT18的表達(dá)
    3 KRT18對胚胎分化作用的影響
        3.1 KRT18隨著小鼠妊娠期的變化而變化
        3.2 KRT18對牛囊胚和囊胚發(fā)育的作用
    4 細(xì)胞角蛋白18（KRT18）與疾病
        4.1 細(xì)胞角蛋白18（KRT18）與癌癥
            4.1.1 細(xì)胞角蛋白18 （KRT18）與肝癌
            4.1.2 細(xì)胞角蛋白18 （KRT18）與乳腺癌
            4.1.3 細(xì)胞角蛋白18 （KRT18）與胃癌
            4.1.4 細(xì)胞角蛋白18 （KRT18）與預(yù)后標(biāo)記物
        4.2 細(xì)胞角蛋白18 （KRT18）與白血病相關(guān)蛋白
    5 相關(guān)研究技術(shù)
    6 存在的問題
    參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]豬滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及ROCK抑制劑Y-27632對其影響的研究[D]. 侯東霞.內(nèi)蒙古大學(xué) 2015
[2]ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN位點的基因打靶研究[D]. 趙宇航.內(nèi)蒙古大學(xué) 2014

碩士論文
[1]RNA模板介導(dǎo)同源重組修復(fù)的探討及不同CRISPR/Cas9系統(tǒng)的比較研究[D]. 韓芙蓉.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016



本文編號：2989389