發(fā)布時間：2021-01-12 06:58

　　內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶是纖維素酶系中的主要成員,可以將可溶性纖維素水解成還原性的寡糖。在酶的眾多生物學性質(zhì)中,其熱穩(wěn)定性非常重要,由于對高溫環(huán)境表現(xiàn)極強耐受力的嗜熱菌細胞中含有耐高溫酶系而極具應用價值和開發(fā)潛力。雖然生長在海底火山環(huán)境中的嚴格厭氧嗜熱微生物海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）具有產(chǎn)生內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的能力,但由于培養(yǎng)困難,不適用工業(yè)規(guī)模的開發(fā)利用,采用分子生物學手段對該菌的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因進行克隆,構(gòu)建可以常溫培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）工程菌意義重大。1)海棲熱袍菌中編碼內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的基因（TM1525）,具有825 bp的開放閱讀框,編碼274個氨基酸。以分泌型pHT43穿梭質(zhì)粒為載體,構(gòu)建融合His標簽蛋白的重組TM1525克隆質(zhì)粒pHT43-TM1525,并通過大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α擴增,大量制備重組質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入B.subtilis WB800N中進行表達。利用水解圈實驗證明重組蛋白表達情況及水解纖維素酶活性。發(fā)酵上清液和菌體沉淀的... 

【文章來源】：東華大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 極端環(huán)境微生物和耐熱酶
        1.1.1 極端環(huán)境微生物
        1.1.2 海洋微生物
        1.1.3 海棲熱袍菌
    1.2 纖維素和內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶
        1.2.1 纖維素
        1.2.2 內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶
    1.3 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)
        1.3.1 枯草芽孢桿菌WB800N
        1.3.2 pHT43穿梭載體
        1.3.3 乳糖操縱子與誘導劑IPTG
        1.3.4 電轉(zhuǎn)化法
    1.4 酶學性質(zhì)研究
        1.4.1 生物信息學軟件分析理化性質(zhì)
        1.4.2 酶學性質(zhì)研究
    1.5 工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化
        1.5.1 單因素試驗
        1.5.2 響應面優(yōu)化
    1.6 研究意義和研究內(nèi)容
        1.6.1 研究意義
        1.6.2 研究內(nèi)容
第二章 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的構(gòu)建
    2.1 主要實驗儀器和材料
        2.1.1 菌種、質(zhì)粒
        2.1.2 主要實驗儀器
        2.1.3 主要實驗材料
    2.2 實驗原理與方法
        2.2.1 PCR擴增及產(chǎn)物的回收
        2.2.2 pMD18-TM1525的構(gòu)建
        2.2.3 pHT43-TM1525重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 pHT43-TM1525重組菌的篩選與鑒定
        2.2.5 枯草芽孢桿菌WB800N表達系統(tǒng)的建立
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 PCR擴增
        2.3.2 pMD18-TM1525陽性克隆菌株的篩選與鑒定
        2.3.3 pHT43-TM1525陽性克隆菌株的篩選與鑒定
        2.3.4 枯草芽孢桿菌陽性克隆菌株的鑒定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 目的蛋白的表達純化及酶學性質(zhì)分析
    3.1 實驗材料、實驗設(shè)備及實驗試劑
        3.1.1 菌種
        3.1.2 實驗設(shè)備
        3.1.3 實驗試劑
    3.2 實驗原理及方法
        3.2.1 目的蛋白的表達
        3.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化
        3.2.3 目的蛋白的純化
        3.2.4 酶學性質(zhì)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 目的蛋白的表達
        3.3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化
        3.3.3 蛋白純化
        3.3.4 酶學性質(zhì)分析
    3.4 本章小結(jié)
第四章 響應面優(yōu)化
    4.1 主要實驗儀器和材料
        4.1.1 菌種
        4.1.2 主要實驗儀器
        4.1.3 主要實驗材料
    4.2 實驗方法
        4.2.1 響應面試驗設(shè)計
        4.2.2 測定方法
        4.2.3 回歸模型驗證
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 響應面試驗方案及結(jié)果
        4.3.2 模型方差分析
        4.3.3 響應面交互作用分析
        4.3.4 響應面優(yōu)化結(jié)果驗證
    4.4 本章小結(jié)
第五章 總結(jié)與展望
    5.1 總結(jié)
    5.2 展望
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]海棲熱袍菌耐熱葡聚糖內(nèi)切酶EG12B基因的克隆表達及酶學特性分析[J]. 王珊珊,任艷艷,張濤,路宏朝,王令.  家畜生態(tài)學報. 2019(04)
[2]海藻糖合酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達[J]. 王希暉,劉洪玲,隋松森,楊少杰,王瑞明,王騰飛.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2019(07)
[3]麥芽糖誘導海藻糖合成酶基因在B.subtilis WB800n中的表達[J]. 劉強,王騰飛,汪俊卿,王希暉,王瑞明.  生物技術(shù)通報. 2017(03)
[4]枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)及其啟動子研究進展[J]. 余小霞,田健,劉曉青,伍寧豐.  生物技術(shù)通報. 2015(02)
[5]大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及堿性蛋白酶的表達[J]. 梁曉梅,黎明,成堃,賈紅紅,路福平.  生物技術(shù)通報. 2011(06)
[6]少根根霉脂肪酶基因在枯草芽孢桿菌中的誘導表達[J]. 張歡,王鳳寰,田平芳,譚天偉,李文進.  生物技術(shù)通報. 2010(01)



本文編號：2972385