隨著沿海地區(qū)人口密度的逐年增多及現(xiàn)代化工業(yè)的發(fā)展,大量的工農(nóng)業(yè)廢水和生活污水被排入到了海洋,從而導(dǎo)致過量的活性氮也從陸地向水體遷移,這種現(xiàn)象成為了河口富營養(yǎng)化的主要原因,由此引起了一系列的環(huán)境危害。反硝化作用是微生物介導(dǎo)的氮循環(huán)中的一個(gè)重要過程,對河口沉積物中過量氮素的去除有著非常重要的意義。作用于反硝化過程的微生物稱為反硝化菌,其中反硝化細(xì)菌種類繁多,分布廣泛,所以常規(guī)的16S rRNA測序法并不能被用于研究其生態(tài)學(xué)特性。本研究采用nirS基因作為分子標(biāo)記來研究反硝化細(xì)菌的多樣性,分別在2016年冬天和夏天沿著珠江口（Pearl River Estuary,PRE）主流的5個(gè)站位進(jìn)行了采樣,從上游到下游分別是PRE-1、PRE-3、PRE-7、PRE-13和PRE-18,每個(gè)站位包括表層,中層和底層,共計(jì)30個(gè)采樣點(diǎn)。我們分別使用¹⁵N標(biāo)記的同位素示蹤測定法、實(shí)時(shí)定量pcr和高通量測序技術(shù)分析了珠江口沉積物中nirS型反硝化細(xì)菌的活性、豐度、多樣性、群落結(jié)構(gòu)以及對環(huán)境因子的響應(yīng),具體研究結(jié)果如下:1.通過分別計(jì)算反硝化功能基因與16S rRNA基因的相似性閾值,... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

自然界微生物氮循環(huán)示意圖

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文7圖1.2Cu-NIRs的三聚體結(jié)構(gòu)及其單體（Admanetal.,1995;Horrelletal.,2017）Figure1.2DomainandoligomericstructureofCu-NIRs注：紫色代表T1Cu；綠色代表T2CuNote:ThepurpleisT1Cu;thegreenisT2Cu1.3.2含cd1型的亞硝酸鹽還原酶細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶（cd1-NIRs）是一種分子量為20kD的二聚體，有細(xì)胞色素c和d1兩種類型，且由nirS基因所編碼[50]。它和銅型亞硝酸鹽還原酶催化的產(chǎn)物都是氣體一氧化氮，同時(shí)伴隨少量的一氧化二氮?dú)怏w。NirS基因在反硝化過程中是極為重要的一個(gè)功能基因，除此之外還是反硝化細(xì)菌分析環(huán)境中反硝化細(xì)菌多樣性的重要的一個(gè)靶基因[51]。所以，研究由nirS基因編碼的酶（細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶）的生物細(xì)胞和分子學(xué)基礎(chǔ)就顯得尤為重要。細(xì)胞色素cd1型和銅型亞硝酸鹽還原酶的功能相同但是結(jié)構(gòu)及催化位點(diǎn)卻不相同。大多數(shù)研究報(bào)道的反硝化細(xì)菌含有cd1型，但也有很多研究證實(shí)了含銅型的反硝化細(xì)菌基因存在于更多的細(xì)菌類別中[52]。Cd1-NIRs是由Radoul等人從Pseudomonasaeruginosa中分離出來的[53]。Cd1-NIRs是一種能夠?qū)喯跛猁}催化成一氧化氮的同株異核生殖蛋白，具有可溶性。它包含兩個(gè)具有60kD重的亞基二聚體，其中每一個(gè)亞基均含有1個(gè)共價(jià)的Hc和1個(gè)Hd1，而Hc分別具有His-17和His-69兩個(gè)軸向的His配體，Hd1和Hc被His-200與Tyr-25連接起來，其中Hd1不僅僅是單核的鐵中心，也是亞硝酸鹽還原的催化活性中心。Hd1位于其中的一個(gè)二聚體中，而Hc位于另一個(gè)二聚體中，它們之間是需要通過轉(zhuǎn)移電子來進(jìn)行催化反應(yīng)的[54]。含有cd1-NIRs的菌株是利用亞硝酸根離子或氧氣等化合物來進(jìn)行呼吸的。此外，Cd1-NIRs不僅是一個(gè)能將亞硝酸鹽還原成一氧化氮的還原酶，它還是具有另外一種催化功?

第1章引言8和cd1-NIRs這兩類亞硝酸鹽還原酶不會同時(shí)出現(xiàn)在同一菌株中[56]。含細(xì)胞色素cd1型的在細(xì)菌中的分布較含銅型的更廣泛。在純菌株中，含銅型的菌株占的比例更大，但研究顯示來自富氧土地的反硝化菌株里很多都含有細(xì)胞色素cd1型，但是也不能排除含有Cu-NIRs的細(xì)菌，只是目前尚未發(fā)現(xiàn)或者是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)但是還未被鑒定[57]。如圖1.3所示。圖1.3Cd1-NIRs的立體結(jié)構(gòu)[錯(cuò)誤！未定義書簽。]Figure1.3Three-dimensionalstructureofcd1-NIRs1.4反硝化細(xì)菌的分子生態(tài)學(xué)研究分析功能基因的多樣性不僅有助于理解不同環(huán)境中的生物地球化學(xué)循環(huán)過程，而且也可以研究基因間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[58]。所以，功能基因特異性引物的發(fā)現(xiàn)是研究環(huán)境中反硝化細(xì)菌的多樣性的第一步。在1998年，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，Braker等人[59]研究出了擴(kuò)增兩種功能基因（nirS和nirK）特異性片段的引物并且還通過PCR將nirK基因和nirS基因擴(kuò)增出來，其中nirK基因是從Alcaligenessp.DSM30128、Alcaligenesxylosoxidans和Blastobacterdenitrificans擴(kuò)增得到的。這對于分子生物技術(shù)以及分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展來說，是一個(gè)新的里程碑。與此同時(shí)，編碼硝酸鹽還原酶的napA基因、編碼一氧化氮還原酶的兩類基因norB、norC以及編碼一氧化二氮還原酶的nosZ基因也先后被應(yīng)用到分子生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)中，這打破了傳遞培養(yǎng)的分析方法，使得反硝化細(xì)菌的豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)在自然環(huán)境中逐步得到了研究，但是為了更準(zhǔn)確地檢測環(huán)境中反硝化細(xì)菌的豐度和多樣性，也可以使傳統(tǒng)的分子培養(yǎng)和生物學(xué)方法相結(jié)合。研究表明[60]，反硝化細(xì)菌更喜歡分布在海洋低氧區(qū)、稻田、土壤甚至沉積物等生境中，在這些生境中的反硝化細(xì)菌功能基因具有很高的多樣性。而且通過分子生物學(xué)技術(shù)還可發(fā)現(xiàn)很多新的反硝化菌種

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：2925398