自然界中的植物生長發(fā)育需要光照、溫度、濕度等外界條件,高等植物通過吸收紅光和遠(yuǎn)紅光的光敏色素及吸收藍(lán)光和紫外-A的隱花色素響應(yīng)環(huán)境。早期在紅光、藍(lán)光和遠(yuǎn)紅光條件下篩選到一個(gè)長下胚軸功能獲得型突變體shb1-D并克隆得到SHB1基因。SHB1基因定位于細(xì)胞核中,目前對于SHB1基因功能的闡釋多集中于其調(diào)控種子胚乳發(fā)育方面,而對其參與植物光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制不甚清楚。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)PIF4作為SHB1下游的一個(gè)直接靶基因,其表達(dá)受到SHB1-CCA1/LHY模塊的調(diào)控,從而促進(jìn)植物達(dá)到光形態(tài)建成的平衡狀態(tài)。在本研究中,我們以shb1-D突變體和野生型Ws為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序與數(shù)據(jù)分析,并從中鑒定得到SHB1的另一個(gè)靶基因GRF7。本研究主要探索了SHB1在紅光下調(diào)控GRF7基因表達(dá)的分子機(jī)制,取得結(jié)果如下:(1)RNA-Seq結(jié)果分析顯示,在shb1-D突變體背景下共有823個(gè)差異表達(dá)基因(︱FC︱1.5,P0.05),表達(dá)上調(diào)的基因有586個(gè),表達(dá)下調(diào)的基因有237個(gè)。對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析,這些基因主要在分子生物學(xué)功能、生物學(xué)過程、細(xì)胞組分這些途徑中均有分布。在參與的分子生物學(xué)功能方面這些差異基因多分布在結(jié)合、催化、電子載體活動(dòng)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性方面;在參與的生物學(xué)過程方面這些差異基因多分布在生物學(xué)過程的調(diào)控、細(xì)胞過程、代謝過程、信號(hào)傳遞過程等方面;在參與構(gòu)成細(xì)胞組分方面這些差異基因多分布在細(xì)胞分離、胞外區(qū)域、膜鑲嵌區(qū)域等方面。(2)這些差異表達(dá)基因中包含標(biāo)志基因PIF4,利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了一些隨機(jī)篩選的差異表達(dá)基因,包括HEMB2、HEC2、CLE19、GRXS2、CO、XTH6的表達(dá)情況,結(jié)果顯示與RNA-Seq數(shù)據(jù)結(jié)果一致,因此本次測序結(jié)果是可信的。(3)在上調(diào)表達(dá)的差異基因中發(fā)現(xiàn)4個(gè)GRF基因家族成員(GRF4/5/6/7),其表達(dá)水平在shb1-D突變體中均上調(diào)。其中,GRF7基因的表達(dá)明顯受到光信號(hào)的抑制而在shb1-D突變體中顯著升高。利用qRT-PCR技術(shù)分別在野生型Ws與突變體shb1-D中分析GRF7基因在紅光、藍(lán)光、遠(yuǎn)紅光的強(qiáng)光(15μmol/m~2/s)與弱光(2μmol/m~2/s)條件下的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示在紅光條件下的表達(dá)狀況與RNA-Seq結(jié)果一致,并且在藍(lán)光、遠(yuǎn)紅光的強(qiáng)光與弱光條件下GRF7基因的表達(dá)均受到明顯的光抑制,且在shb1-D突變體中GRF7基因的表達(dá)顯著升高。暗示著GRF7基因可能會(huì)參與植物的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路。(4)觀察grf7突變體與野生型Col在黑暗和紅光條件下的表型,與Col野生型相比,在紅光條件下grf7單突變體下胚軸長度明顯降低,暗示著GRF7參與SHB1介導(dǎo)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。(5)將GRF7基因的啟動(dòng)子分成五部分P1-P5,利用pSHB1::SHB1-Myc轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行ChIP-qPCR分析,結(jié)果表明SHB1可以結(jié)合到GRF7基因的啟動(dòng)子的P3與P4片段,說明GRF7基因是受SHB1調(diào)控的直接靶基因。(6)以野生型Ws為材料,分別用CCA1或LHY內(nèi)源抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀分析。ChIP-qPCR分析表明CCA1/LHY可以結(jié)合到GRF7基因的啟動(dòng)子的P4片段,說明CCA1/LHY是可以將SHB1招募至GRF7基因啟動(dòng)子區(qū)域的蛋白因子。(7)利用qRT-PCR分別在突變體grf7與野生型Col中分析SHB1基因在黑暗與紅光3 h、9 h條件下的表達(dá)情況,結(jié)果表明在紅光條件下grf7突變體中SHB1表達(dá)下降,說明GRF7在光下可以促進(jìn)SHB1基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過RNA-Seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)SHB1調(diào)控GRF7基因的表達(dá),同時(shí),ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證明GRF7是SHB1在響應(yīng)紅光信號(hào)過程中的直接靶基因。這一發(fā)現(xiàn)首次證明了GRF7基因參與調(diào)控植物的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,有助于我們理解SHB1在植物光形態(tài)建成中的作用。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文7圖1-1植物幼苗去黃化（Quail,2002）Fig.1-1Thede-etiolationofplantseedlings1.1.1植物光受體自然界中的植物通過不斷地進(jìn)化形成了接收各種波長的光受體。這些光受體能感知到植物周圍的光強(qiáng)的變化、光方向的變化以及光周期的變化等，從而進(jìn)一步響應(yīng)植物體內(nèi)的各種變化。光受體在模式植物擬南芥中研究的比較透徹（圖1-2），其中主要的光受體有：接收280～315nm紫外光的紫外光受體（UVR8）；接收315～500nm藍(lán)光的隱花色素1和2（CRY1和CRY2）以及向光素（phototropin）；接收600～750nm波長的紅光和遠(yuǎn)紅光的光敏色素（PHY）（李秀坤，2019）。在瞬息萬變的的光環(huán)境下，植物光受體感受到變化后就會(huì)開啟精確的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制去應(yīng)對不同的光信號(hào)，保證自身系統(tǒng)的正常運(yùn)行。圖1-2模式植物擬南芥的光受體（李秀坤，2019）Fig.1-2PhotoreceptorsinArabidopsisthaliana

擬南芥SHB1在紅光下調(diào)控GRF7基因表達(dá)的機(jī)制研究12圖1-4隱花色素CRY信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的工作模型（Liuetal.,2011b;Wangetal.,2017）Fig.1-4WorkingmodelsofthesignaltransductionmechanismofArabidopsiscryptochromes研究者在擬南芥突變體nph1中克隆得到向光素（phototropin,PHOT），該突變體是失去向光性的下胚軸突變，沒有向光反應(yīng)，重命名PHOT，編碼向光素蛋白（Christieetal.,1999）。向光素與植物的向光生長、葉綠體的運(yùn)動(dòng)、葉片的伸展等相關(guān)。向光素是一種蛋白激酶，包括PHOT1和PHOT2兩個(gè)成員，介導(dǎo)植物的向光生長（Christie,2007;Takemiyaetal.,2005）。在向光素的N端有LOV1、LOV2兩個(gè)保守序列，C端由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成（Hualaetal.,1997;Christieetal.,1999;BriggsandChristie,2002）。PHOT1和PHOT2不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，如果對其進(jìn)行黑暗處理發(fā)現(xiàn)會(huì)分布在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)（SakamotoandBriggs,2002;Kongetal.,2006）。若處于藍(lán)光條件下，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)部分PHOT1蛋白（SakamotoandBriggs,2002;Wanetal.,2008），一部分PHOT2蛋白與高爾基體結(jié)合在一起（Kongetal.,2006）。PHOT1和PHOT2在擬南芥中的分布并不均勻，PHOT1在根中比較豐富而PHOT2在根中含量較少，擬南芥根的向光性生長主要由PHOT1調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)光可使向光素分子內(nèi)的LOV2上的絲氨酸發(fā)生自磷酸化，促使向光素激活，從而進(jìn)一步調(diào)控植物光形態(tài)的建成（Salomonetal.,2003;Sullivanetal.,2008;Okajimaetal.,2011）。1.1.1.3UVR8在擬南芥中有一組感光體，它們可以感知從UV-B到太陽光譜的遠(yuǎn)紅光部分的整個(gè)光譜范圍，該感光體包括迄今為止唯一的特定于UV-B的感光受體即UVR8（UVRESISTANCELOCUS8），能夠?qū)VB作出響應(yīng)（Rizzinietal.,2011）。UVR8的作用是抑制下胚軸伸長，刺激光保護(hù)

擬南芥SHB1在紅光下調(diào)控GRF7基因表達(dá)的機(jī)制研究14圖1-5UVR8介導(dǎo)的信號(hào)通路（VanesaEleonoraTossietal.,2019）Figure.1-5UVR8-mediatedsignaltransductionmodel1.1.2光敏色素互作因子研究發(fā)現(xiàn)光敏色素經(jīng)過紅光的誘導(dǎo)后，由沒有生物活性狀態(tài)的Pr形式轉(zhuǎn)變成生理活化型的Pfr形式隨之進(jìn)入細(xì)胞核，然后與光敏色素互作因子PIFs結(jié)合，在細(xì)胞核內(nèi)PIFs被磷酸化與泛素化修飾，隨后進(jìn)入26S蛋白酶體降解途徑，促進(jìn)植物光形態(tài)的建成（圖1-6）。PIFs屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，在光信號(hào)誘導(dǎo)的植物生長發(fā)育過程中起著中心樞紐的作用，在植物的光形態(tài)建成、幼苗去黃化、暗形態(tài)建成、生物鐘、植物的避蔭反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。
【參考文獻(xiàn)】

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1 韓瑤瑤;馬燕勤;李典珍;徐子勤;;擬南芥Pri-miR156a基因?qū)煵蓍_花時(shí)間的影響[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2015年02期

2 錢珊珊;侯學(xué)文;;植物UV-B生理效應(yīng)的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];植物生理學(xué)報(bào);2011年11期

本文編號(hào)：2873491