復(fù)制起始識(shí)別復(fù)合體6(Orc6)是與DNA復(fù)制起始有關(guān)的蛋白質(zhì),是復(fù)制起始識(shí)別復(fù)合體(ORC)中唯一與AAA+ATP酶無(wú)關(guān)的亞基,對(duì)真核生物DNA復(fù)制起始發(fā)揮著重要作用。目前除DNA復(fù)制以外,Orc6還在異染色質(zhì)形成、紡錘體組裝等方面發(fā)揮作用,然而到目前為止,其在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNAi技術(shù)研究Orc6基因的在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用,研究發(fā)現(xiàn)Orc6基因敲除的純合胚胎致死。然后通過(guò)RNAi技術(shù)構(gòu)建敲低模型,以獲得充足的胚胎研究Orc6在小鼠植入前早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用。1.Orc6~(-/-)胚胎表型分析通過(guò)取E7.5和E3.5的后代進(jìn)行表型分析,我們發(fā)現(xiàn)E 7.5的胚胎基因型比例失調(diào),但E3.5胚胎的基因型比例符合孟德?tīng)栠z傳定律,推測(cè)Orc6~(-/-)胚胎的死亡時(shí)間在E3.5-E7.5之間,接著對(duì)E3.5胚胎進(jìn)行Outgrowth培養(yǎng),純合胚胎沒(méi)有突破透明帶。2.Orc6 mRNA在植入前早期胚胎中的表達(dá)利用定量PCR技術(shù)對(duì)Orc6在卵母細(xì)胞以及早期胚胎的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)Orc6的表達(dá)在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期并無(wú)規(guī)律可循。從卵母細(xì)胞至受精卵階段Orc6 mRNA的表達(dá)量顯著增加,2-cell期下降,4-cell和8-cell期表達(dá)量增加,桑葚胚期的表達(dá)逐漸下降,到囊胚期表達(dá)量到達(dá)最低。3.Orc6基因沉默對(duì)植入前早期胚胎發(fā)育的影響胞漿注射Orc6 siRNA建立胚胎敲低模型,通過(guò)免疫熒光、定量PCR等技術(shù),了解Orc6對(duì)小鼠胚胎發(fā)育第一、二次譜系分化的影響,以及Orc6基因缺失對(duì)細(xì)胞凋亡以及紡錘體組裝的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Orc6會(huì)通過(guò)影響PrE細(xì)胞命運(yùn)決定的調(diào)節(jié)因子Sox17的表達(dá),來(lái)影響PrE細(xì)胞命運(yùn)分配。除此以外,Orc6基因沉默會(huì)導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)無(wú)法修復(fù)的DNA損傷,但Orc6基因沉默并不影響紡錘體組裝。綜上,Orc6基因沉默影響PrE細(xì)胞的命運(yùn)分配,且導(dǎo)致不可修復(fù)的DNA損傷,但對(duì)紡錘體的正確組裝沒(méi)有影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn),我們對(duì)Orc6基因功能有了進(jìn)一步的了解,為胚胎發(fā)育第二譜系分化的研究提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：阜陽(yáng)師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：Q132.4
【部分圖文】：

阜陽(yáng)師范大學(xué)碩士學(xué)位論文3圖1.1內(nèi)外模型[18]Fig1.1TheInside–OutsideModel[18]1.3.1.2細(xì)胞極性模型（TheCellPolarityModel）細(xì)胞極性模型是根據(jù)卵裂方向以及細(xì)胞極性導(dǎo)致的細(xì)胞位置決定的，即卵裂球在胚胎內(nèi)獲得的位置是由其分裂方向決定的。如果8到16細(xì)胞階段，卵裂球的有絲分裂紡錘體的方向垂直于頂端-基底外側(cè)軸，則分裂方向與其平行，卵裂球細(xì)胞被分裂形成的兩個(gè)子細(xì)胞，這兩個(gè)子細(xì)胞都繼承頂端區(qū)和基底外側(cè)的成分，這種“對(duì)稱分裂”產(chǎn)生的兩個(gè)相同的子細(xì)胞在大多數(shù)情況下都將保持極化狀態(tài)并位于胚胎的外部位置。如果有絲分裂平行于頂端-基底外側(cè)軸，則產(chǎn)生的分裂平面垂直于該軸，這種分裂模式產(chǎn)生了兩個(gè)不同的子細(xì)胞，一個(gè)子細(xì)胞擁有親代的頂端區(qū)，保持極化狀態(tài)位于胚胎外部；而另一個(gè)則擁有了親代細(xì)胞基底外側(cè)區(qū)域，變?yōu)榉菢O性，位于胚胎內(nèi)部[19]。然而這個(gè)想法是根據(jù)沒(méi)有直接觀察完整胚胎的分離的卵裂球結(jié)果提出的，與胚胎的不對(duì)稱分裂的方向具有一定的相關(guān)性，除了平行或垂直于頂端-基地外側(cè)膜兩種分裂方式以外，還出現(xiàn)傾斜分裂的現(xiàn)象[20,21]。這種傾斜的分裂使頂端區(qū)在子代細(xì)胞之間不均勻分配，并且兩者均占據(jù)胚胎外部位置，這種極性的不對(duì)稱分布導(dǎo)致了極化程度較低的外部細(xì)胞內(nèi)部化[22]，這種內(nèi)化過(guò)程主要是由外部的少極化細(xì)胞非接觸表面的表

第1章引言4面收縮力增加導(dǎo)致的，這種表面收縮力主要是由磷酸化的肌球蛋白Ⅱ在起作用。用肌球蛋白抑制劑Blebistin阻斷肌球蛋白的收縮性，會(huì)阻止少極性的外部細(xì)胞發(fā)生內(nèi)化。磷酸化的肌球蛋白在非極性外部細(xì)胞的非接觸區(qū)積累，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)非極性外部細(xì)胞內(nèi)部化，但同時(shí)頂端蛋白在極性部位會(huì)對(duì)抗這種肌動(dòng)球蛋白的收縮以防止其內(nèi)部化[22]（圖1.2）。圖1.2極性模型[18]Fig1.2TheCellPolarityModel[18]1.3.2影響譜系分化的基因和信號(hào)通路1.3.2.1Cdx2Cdx2是TE細(xì)胞的標(biāo)記基因之一，在TE形成過(guò)程中，Cdx2是TE發(fā)育所必需的同源盒轉(zhuǎn)錄因子，Cdx2敲除胚胎因?yàn)闊o(wú)法形成成熟的TE而導(dǎo)致植入失敗，并且滋養(yǎng)層的缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎無(wú)法擴(kuò)大成腔。除此之外，Cdx2基因缺失的胚胎中，ICM的特異性轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Nanog在TE中表達(dá)，表明CDX2是抑制TE中Oct4和Nanog表達(dá)所必須[23]。從在8細(xì)胞階段開(kāi)始，CDX2與OCT4和NANOG在整個(gè)胚胎的全部卵裂球中相對(duì)均勻的表達(dá)，直到囊胚中期和晚期才逐漸在TE細(xì)胞中特異性表達(dá)[24,25]（圖1.3B）。在內(nèi)外細(xì)胞以及囊胚的形成過(guò)程中，CDX2首先在TE中特異性表達(dá)，隨后OCT4在ICM中特異性表達(dá)[26]。除了相互抑制以外，胚胎中還存在連接細(xì)胞位置與Cdx2表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)通路Hippo信號(hào)通路。該通路最初在果蠅中被確認(rèn)為是控制器官大小的信號(hào)通路[27,28]，并且在哺乳動(dòng)物中保守，并被用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡以及干細(xì)胞維持等。

第1章引言641]。Hippo信號(hào)通路在空間上的差異性的激活確保了只有外部細(xì)胞才能表達(dá)滋養(yǎng)外胚層基因Cdx2，而內(nèi)部細(xì)胞由于不會(huì)向滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞命運(yùn)決定做出任何貢獻(xiàn)，因此不適當(dāng)?shù)募せ罨蜣D(zhuǎn)錄會(huì)被阻止（圖1.3C）[42]。圖1.3TE和ICM細(xì)胞命運(yùn)決定的分子機(jī)制[43]Fig1.3MolecularmechanismforthespecificationofTEandICMfates[43]在依據(jù)細(xì)胞位置調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路的過(guò)程中，血管動(dòng)蛋白（Angiomotin，AMOT）發(fā)揮了作用[44,45]，AMOT位于LAST激酶發(fā)上游，是Lats1/2激酶的激活因子，首次在8細(xì)胞期胚胎的極膜區(qū)有較低表達(dá)；但從16細(xì)胞開(kāi)始，AMOT在內(nèi)外細(xì)胞的定位有了顯著的變化，雖然AMOT定位于內(nèi)部細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞膜，但在外部細(xì)胞，AMOT只定位在頂端區(qū)[45]。正是這種在空間上完全不同的內(nèi)部/非極性細(xì)胞和外部/極性細(xì)胞之間的蛋白分布的差異，對(duì)建立、驅(qū)動(dòng)第一個(gè)細(xì)胞命運(yùn)決定的Hippo信號(hào)通路的激活至關(guān)重
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本文編號(hào)：2868094