發(fā)布時(shí)間：2017-04-03 00:20

  本文關(guān)鍵詞：水稻OsHSP90基因的克隆及功能初步分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻是世界性的糧食作物,其產(chǎn)量以及品質(zhì)受逆境脅迫的影響非常顯著。因此水稻抗逆研究一直是稻作科學(xué)研究的重要課題。近年來,隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的進(jìn)步,逆境相關(guān)基因的研究取得了很大進(jìn)展,一些逆境相關(guān)基因已被相繼發(fā)現(xiàn)并被克隆到水稻中,并獲得了抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植株。這將有助于了解水稻在耐逆方面的分子作用機(jī)制,為篩選和培育水稻抗逆品種提供了重要的指導(dǎo)意義。熱激蛋白(Heat Shock Protein)HSP90是生物體內(nèi)廣泛存在的一類重要的逆境相關(guān)蛋白,不僅在逆境條件下高效表達(dá),而且在正常生活的細(xì)胞中也廣泛存在。作為生物體內(nèi)重要的分子伴侶之一,它能在正常以及逆境脅迫下,幫助作用蛋白正確完成折疊、使其空間構(gòu)象保持完整以及維持其生物學(xué)功能,同時(shí)與許多底物蛋白結(jié)合形成復(fù)合體參與調(diào)控細(xì)胞生理代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外,大量研究表明其超表達(dá)后能夠增強(qiáng)植物體的抗逆性。本研究室在早期階段通過熒光差顯技術(shù)篩選到一個(gè)水稻熱激蛋白HSP90,其定位在水稻日本晴9號染色體上。在此基礎(chǔ)上,本論文主要討論了它在水稻體內(nèi)所行使的一些生物學(xué)功能,為進(jìn)一步深入研究OsHsp90基因在逆境應(yīng)答中所起的調(diào)控作用打下一定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：1.對OsHSP90基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼框?yàn)?100 bp,編碼699個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)約為4.97,預(yù)測分子量為80.19 kDa。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明第30-179 AA殘基構(gòu)成一個(gè)ATPase結(jié)構(gòu)域,第185-699 AA殘基是Hsp90蛋白超家族典型結(jié)構(gòu)域。2.運(yùn)用實(shí)時(shí)qRT-PCR技術(shù)分析了水稻日本晴中OsHSP90基因在高溫、干旱、鹽脅迫等逆境處理下的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)OsHSP90基因是一個(gè)多逆境誘導(dǎo)基因,并且受熱激影響最顯著。3.構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體,并對其進(jìn)行了體外誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)探究了表達(dá)OsHSP90蛋白的大腸桿菌在逆境條件下的生長狀況,結(jié)果顯示該基因的表達(dá)能增強(qiáng)大腸桿菌的耐高溫性和耐滲透脅迫性,而與大腸桿菌的耐鹽性的提高似乎沒有太大關(guān)系。4.構(gòu)建了其轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因純合植株,然后對其進(jìn)行了高溫脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫逆境處理,發(fā)現(xiàn)OsHSP90的超表達(dá)能增強(qiáng)水稻對高溫脅迫的抗逆性,與水稻耐旱性的提高也有一定關(guān)系,而對水稻耐鹽性的提高似乎沒什么直接作用。5.構(gòu)建了該基因的GFP載體,以確定其亞細(xì)胞定位,不過實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行之中。
【關(guān)鍵詞】：水稻 OsHSP90 轉(zhuǎn)基因 原核表達(dá) 逆境處理
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-24
• 第一節(jié) 植物逆境生理10-14
• 1. 高溫脅迫對植物的影響10-13
• 1.1 高溫脅迫對植物生長發(fā)育的影響10-11
• 1.2 高溫脅迫對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞11
• 1.3 高溫抑制植物的光合作有和呼吸作用11
• 1.4 高溫脅迫對植物外觀形態(tài)的影響11-12
• 1.5 高溫對植物體內(nèi)水分影響12
• 1.6 高溫脅迫對植物抗氧化系統(tǒng)的影響12
• 1.7 高溫脅迫對植物激素的影響12-13
• 2、其他逆境脅迫對植物的影響13-14
• 2.1 干旱脅迫對植物的影響13
• 2.2 低溫脅迫對植物的影響13-14
• 2.3 高鹽脅迫對植物的影響14
• 第二節(jié) 熱激蛋白(Hsps)研究進(jìn)展14-24
• 1. Hsp的發(fā)現(xiàn)14-15
• 2. Hsp的分類15
• 3. Hsp的結(jié)構(gòu)上特點(diǎn)15-16
• 4. Hsp的主要功能16-18
• 4.1 Hsp的分子伴侶功能16
• 4.2 Hsp與信號傳遞16-17
• 4.3 Hsp調(diào)控細(xì)胞凋亡17
• 4.4 Hsp與植物的抗逆性17-18
• 5. Hsp90家族研究進(jìn)展18-19
• 5.1 HSP90家族18-19
• 5.2 HSP90家族功能域19
• 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR19-22
• 6.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理20
• 6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法20-21
• 6.3 實(shí)時(shí)定量PCR的優(yōu)點(diǎn)21
• 6.4 實(shí)時(shí)定量PCR的缺點(diǎn)21-22
• 6.5 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的應(yīng)用22
• 6.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的展望22
• 7. 本研究的目的與意義22-24
• 第二章 OsHsp90基因的克隆及表達(dá)分析24-38
• 1. 材料與方法24-31
• 1.1 植物材料、菌種和載體24
• 1.2 主要儀器24
• 1.3 主要試劑及培養(yǎng)基24-25
• 1.3.1 主要試劑24-25
• 1.3.2 主要培養(yǎng)基25
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法25-30
• 1.4.1 水稻日本晴逆境處理25-26
• 1.4.2 處理樣品RNA提取26
• 1.4.3 RNA純化26-27
• 1.4.4 RNA反轉(zhuǎn)錄27
• 1.4.5 OsHSP90基因的克隆27-30
• 1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR30-31
• 1.5.1 引物設(shè)計(jì)30-31
• 1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR31
• 1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理31
• 2. 結(jié)果與分析31-38
• 2.1 OsHSP90基因的克隆31-32
• 2.2 OsHSP90基因生物信息學(xué)分析32-35
• 2.2.1 OsHSP90基因的啟動(dòng)子序列分析32-33
• 2.2.2 OsHSP90蛋白的氨基酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建33-35
• 2.3 OsHSP90基因的在線表達(dá)分析35-36
• 2.4 OsHSP90基因在逆境條件下的表達(dá)分析36-38
• 第三章 OsHSP90基因的原核表達(dá)及抗逆試驗(yàn)38-48
• 1. 材料與方法38-43
• 1.1 菌株和質(zhì)粒38
• 1.2 主要儀器38
• 1.3 主要試劑和培養(yǎng)基38-39
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法39-43
• 1.4.1 pET-32a：OsHSP90載體的構(gòu)建39-40
• 1.4.2 融合蛋白的表達(dá)40-42
• 1.4.3 純化融合蛋白42
• 1.4.4 表達(dá)水稻OsHSP90的大腸桿菌的抗逆實(shí)驗(yàn)42-43
• 2. 結(jié)果與分析43-48
• 2.1 pET-32a：OsHSP90重組載體的構(gòu)建43-44
• 2.2 融合蛋白的表達(dá)44-45
• 2.3 表達(dá)OsHSP90蛋白的大腸桿菌的抗逆分析45-48
• 第四章 OsHSP90轉(zhuǎn)基因植株的獲得48-67
• 1. 材料與方法48-61
• 1.1 植物材料、菌株及載體48-49
• 1.2 主要試劑及培養(yǎng)基49
• 1.2.1 主要試劑49
• 1.2.2 主要培養(yǎng)基49
• 1.3 主要儀器49-50
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法50-61
• 1.4.1 pCAMBIA1300：OsHSP90超表達(dá)載體及抑制表達(dá)載體的構(gòu)建50-52
• 1.4.2 pCAMBIA1300：OsHSP90-GFP載體的構(gòu)建52-55
• 1.4.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因載體遺傳轉(zhuǎn)化55-56
• 1.4.4 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得56-57
• 1.4.6 轉(zhuǎn)基因水稻的檢測57-59
• 1.4.7 水稻原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化59-61
• 1.4.8 實(shí)時(shí)qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株61
• 2. 結(jié)果與分析61-67
• 2.1 pCAMBIA1300：OsHSP90超表達(dá)載體以及反義載體的構(gòu)建61-62
• 2.2 重組pCAMBIA1300：OsHSP90-GFP載體的構(gòu)建62-63
• 2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得63
• 2.4 OsHSP90陽性轉(zhuǎn)基因植株的檢測63-67
• 2.4.1 潮霉素抗性的快速檢測63-64
• 2.4.2 PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因植株64-65
• 2.4.3 后代轉(zhuǎn)基因種子潮霉素發(fā)芽檢測65-66
• 2.4.4 轉(zhuǎn)基因幼苗中OsHSP90基因的表達(dá)量檢測66-67
• 第五章 T2代純合轉(zhuǎn)基因植株逆境處理67-76
• 1. 材料與方法67-68
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料67
• 1.2 藥品及培養(yǎng)基67
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法67-68
• 2. 結(jié)果與分析68-76
• 第六章 總結(jié)與討論76-79
• 參考文獻(xiàn)79-85
• 致謝85-86
• 攻讀碩士期間參與發(fā)表論文86

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 杜延飛;水稻OsHSP90基因的克隆及功能初步分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：水稻OsHSP90基因的克隆及功能初步分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：283413