【摘要】：新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是禽副黏病毒1型(avian paramyxovirus serotype-1,APMV-1)的代表種,其廣泛分布于世界各地,也是嚴(yán)重危害世界家禽健康最主要的病原之一。盡管NDV只有單一血清型,但卻存在著多種致病型與基因型。NDV各基因型之間的基因組差異性很大。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者通常將NDV分為class I和class II兩大類:class I型主要分離于野鳥和家禽,且絕大多數(shù)鑒定毒株為無(wú)致病性毒株;class II型通常分離自家禽及其他多種禽類,其從無(wú)致病性、低致病性、中等致病性到高致病性毒株均有,并構(gòu)成了連續(xù)的毒力譜。其中的強(qiáng)毒株常引發(fā)新城疫(Newcastle disease,ND)疫情,并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,已成為危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要病毒之一。Class II型NDV又可細(xì)分為16個(gè)基因型;當(dāng)前,在世界范圍內(nèi),所流行的ND以class II NDV中的基因VII型毒株為主,但近年來(lái)class I型NDV的分離率也在不斷增加。NDV感染后引起機(jī)體各組織不同程度的病理反應(yīng)及臨床癥狀,反映了NDV致病能力的高低,然而,對(duì)產(chǎn)生該差異的原因,迄今尚未完全明確。巨噬細(xì)胞作為宿主天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,是一類重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞,其可通過(guò)極化分型并分泌細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)炎癥、抵御病原的感染。同時(shí),巨噬細(xì)胞還能夠表達(dá)多種Toll樣受體(TLRs)以識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(PAMP)從而啟動(dòng)宿主天然免疫應(yīng)答,其中,TLR7是抵抗病毒感染過(guò)程中的關(guān)鍵分子。目前,關(guān)于雞巨噬細(xì)胞的抗病毒功能研究還鮮有報(bào)道,鑒于此,本研究分別以class II型NDV強(qiáng)毒株、class II型NDV弱毒株及class I型NDV弱毒株感染雞巨噬細(xì)胞(HD11),通過(guò)檢測(cè)雞巨噬細(xì)胞在不同感染時(shí)間點(diǎn)上病毒載量、極化標(biāo)志基因和抗病毒因子的m RNA表達(dá)水平,以比較不同毒力NDV感染所致雞巨噬細(xì)胞極化分型的差異與影響,并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了激活的TLR7對(duì)NDV強(qiáng)弱毒感染后雞巨噬細(xì)胞中病毒載量、極化分型及其抗病毒感染的作用機(jī)制,旨在闡明不同毒力NDV感染所引起的病理反應(yīng)差異的原因,為抗感染免疫調(diào)節(jié)劑的篩選和研發(fā)提供確鑿依據(jù)。本研究主要內(nèi)容如下:1.NDV強(qiáng)、弱毒株感染對(duì)雞巨噬細(xì)胞極化分型的影響本研究首先以本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存的class I型NDV F55株為參考毒株,成功建立了針對(duì)class I型NDV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。之后,選取2株不同毒力的NDV毒株(class II基因VII型強(qiáng)毒株NA-1、class II基因II型弱毒株La Sota)以及1株class I型弱毒株F55分別感染雞巨噬細(xì)胞(HD11),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),對(duì)HD11細(xì)胞感染后不同時(shí)間點(diǎn)上的感染毒株的病毒載量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示:在感染后至24 h期間,三個(gè)實(shí)驗(yàn)毒株在HD11細(xì)胞中都呈現(xiàn)出病毒載量持續(xù)上升;感染后24~72 h期間,強(qiáng)毒株在HD11細(xì)胞中的病毒載量仍呈現(xiàn)出持續(xù)上升狀態(tài),而兩株弱毒株的載量卻一直保持著相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),且在感染24 h之后,二者的載量與強(qiáng)毒株相比呈現(xiàn)出越來(lái)越顯著差異狀態(tài)。為闡明產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因,本研究進(jìn)一步對(duì)HD11細(xì)胞內(nèi)M1型、M2型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志基因、TLR7及I型干擾素(IFN-α、β)的m RNA水平進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,強(qiáng)毒株感染后,HD11細(xì)胞呈現(xiàn)出劇烈的M1型及M2型混合極化特征,產(chǎn)生大量IFN-α、IFN-β,進(jìn)而抑制了TLR7表達(dá);而弱毒株感染后,僅呈現(xiàn)出輕微的單一極化型特征及I型干擾素變化,因而尚不足以明顯影響TLR7的m RNA水平。此外,為進(jìn)一步探究病毒的復(fù)制及其核酸對(duì)雞巨噬細(xì)胞的影響,本研究還采用紫外照射2 h的方法對(duì)病毒進(jìn)行滅活處理,并以此滅活病毒接種HD11細(xì)胞后再作檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:HD11細(xì)胞在用紫外滅活的class I型弱毒株刺激后,其M1和M2的標(biāo)志基因水平均較對(duì)照組有顯著上調(diào),并呈現(xiàn)出了與強(qiáng)毒株感染后相似的變化與變化趨勢(shì);而同樣滅活后的強(qiáng)毒株和class II型弱毒株則并無(wú)明顯影響。由此推測(cè),class I型NDV可能具有某種尚未知的作用機(jī)制,此有待于今后的進(jìn)一步探究。2.TLR7對(duì)NDV感染后雞巨噬細(xì)胞功能作用的影響及其抗病毒機(jī)制的研究為進(jìn)一步探究TLR7在NDV感染雞巨噬細(xì)胞中的作用,本研究預(yù)先用TLR7特異性配體Loxoribine激活HD11細(xì)胞內(nèi)的TLR7,然后再用NDV感染TLR7激活后的HD11細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TLR7的激活能夠顯著降低NDV強(qiáng)毒株感染后HD11細(xì)胞內(nèi)病毒載量,抑制了HD11細(xì)胞M1、M2混合極化趨勢(shì),并降低細(xì)胞上清中乳酸脫氫酶(LDH)的含量;而TLR7的激活僅使class II型弱毒株感染后的HD11細(xì)胞呈現(xiàn)出輕微的M1/M2混合極化狀態(tài),抑制了病毒的復(fù)制,但對(duì)class I型弱毒株感染后的HD11細(xì)胞則并無(wú)明顯影響。這些結(jié)果表明:TLR7激活后,可以抑制強(qiáng)毒NDV在HD11細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,減輕了強(qiáng)毒NDV感染所致的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,進(jìn)而緩解其所致的細(xì)胞損傷。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2793722