發(fā)布時間：2020-07-02 18:52

【摘要】：兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)又稱兔瘟,是一種能夠引起家兔出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀以及快速死亡的一種急性高致病性傳染病。兔群一旦感染,發(fā)病率和死亡率均可高達(dá)100%,是嚴(yán)重影響?zhàn)B兔業(yè)健康發(fā)展的重要兔病之一。本研究根據(jù)已發(fā)表RHDV基因組序列,針對VP60基因前900 bp片段(AB區(qū))設(shè)計兩條表達(dá)引物,通過RT-PCR擴(kuò)增、酶切、連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-VP60,轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中,挑取陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng),用IPTG (1mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化,收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western-blotting鑒定,并進(jìn)行重組蛋白的Ni-TED親和層析法純化和其反應(yīng)原性ELISA檢測。結(jié)果構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-VP60在濃度為lmmol/L IPTG,誘導(dǎo)表達(dá)3-4h可獲得約85.3 kD大小重組蛋白,表達(dá)重組蛋白的間接ELISA結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白能與免疫陽性RHDV抗體特異性結(jié)合特性,具有良好的反應(yīng)活性。以羊抗兔IgG和鼠抗重組蛋白IgG分別標(biāo)記T線和C線設(shè)計RHDV抗體檢測試紙條,通過膠體金的制備、重組VP60蛋白標(biāo)記、鼠源重組VP60抗體的制備,T線和C線蛋白用量的優(yōu)化,特異性和敏感性實(shí)驗,初步試制了可用于兔抗RHDV抗體檢測的免疫膠體金試紙條,結(jié)果顯示研制的膠體金試紙條具有良好的靈敏性和特異性,其免疫血清靈敏度可達(dá)到1：16；除了兔抗RHDV血清的檢測線出現(xiàn)紅色條帶外,其他陰性血清、兔抗巴氏桿菌血清和PBS液檢測線均無顯色條帶,為RHDV的防控提供了一種新的檢測技術(shù)。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2738550