【摘要】：固定化酶技術(shù)是現(xiàn)代生物催化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),而提高酶的穩(wěn)定性也是其工業(yè)化應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。酶通過固定化以后,可以明顯地提高對外界不良環(huán)境的抗性。隨著生物催化劑在工業(yè)生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用,傳統(tǒng)單一的酶固定化方法如吸附固定、包埋固定、共價(jià)結(jié)合固定和交聯(lián)固定等已經(jīng)不能滿足工業(yè)化發(fā)展的需求。因此,固定化酶技術(shù)的相關(guān)研究已經(jīng)向著雙重或者多重的復(fù)合固定化以及非傳統(tǒng)的酶固定化方向發(fā)展。這些新型酶固定化方法給酶的固定化發(fā)展提供了一種新的思路,能夠有效地解決傳統(tǒng)酶固定化技術(shù)存在的不足之處,制備出更加符合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用需求的固定化酶體系。本文以杏仁β-葡萄糖苷酶作為研究對象,基于水相原位聚合技術(shù)平臺,設(shè)計(jì)和制備了幾種不同尺度、不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的新型固定化β-葡萄糖苷酶,以提高酶的穩(wěn)定性。首先分別對所制備的β-葡萄糖苷酶納米凝膠、交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體(CLEAs)凝膠和杏仁粉凝膠的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行一系列表征,然后進(jìn)一步對其制備工藝條件、酶學(xué)性質(zhì)以及催化性能等方面進(jìn)行系統(tǒng)的研究和討論,為其工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下:(1)采用水相原位聚合技術(shù)兩步反應(yīng)制備了 β-葡萄糖苷酶納米凝膠,通過對制備工藝條件的優(yōu)化,β-葡萄糖苷酶納米凝膠的酶活保留率可達(dá)81.4%。紅外光譜、凝膠電泳、動態(tài)光散射、掃描電鏡和熒光光譜等分析結(jié)果顯示,所制備的β-葡萄糖苷酶納米凝膠為單分子酶納米凝膠,粒徑主要分布在15nm～40nm之間,納米凝膠層厚度約為3.5nm,而且保持了天然酶蛋白結(jié)構(gòu)。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,β-葡萄糖苷酶納米凝膠的Km值為3.61mmol/L,Vmax值為2.52μmol/(min·mg),較天然酶對底物的親和力僅略有下降,但β-葡萄糖苷酶納米凝膠的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性以及儲存穩(wěn)定性等方面較天然酶都有顯著提高。(2)利用β-葡萄糖苷酶納米凝膠作為催化劑,以葡萄糖和酪醇為底物,在非水相體系中逆水解反應(yīng)直接糖基化合成紅景天苷。對影響合成紅景天苷的多種因素如反應(yīng)體系的有機(jī)溶劑種類、含水量、加酶量、pH、溫度和底物濃度等作了考察。實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)條件為:以叔丁醇作為有機(jī)溶劑,反應(yīng)體系含水量為5%,加酶量為4.0U/mL,反應(yīng)體系pH值為6.0,反應(yīng)溫度為60℃,葡萄糖和酪醇的濃度分別為300mmol/L和900mmol/L。在此條件下,經(jīng)過96h的反應(yīng),紅景天苷的濃度為71.13mmol/L,收率達(dá)到23.7%。(3)采用三相法從苦杏仁粗酶提取液中分離制備β-葡萄糖苷酶。分別研究了有機(jī)溶劑種類及濃度、硫酸銨飽和度、體系pH值和溫度對三相分離過程的影響。研究結(jié)果表明:叔丁醇作為最佳有機(jī)溶劑,粗提物與叔丁醇的體積比為1.0:1.5,硫酸銨飽和度為50%,體系最佳pH值為5.0,最佳溫度為25℃。在此優(yōu)化條件下,苦杏仁β-葡萄糖苷酶的純化倍數(shù)達(dá)到5.97,酶活回收率為85.7%。(4)以三相法分離制備的杏仁β-葡萄糖苷酶為研究對象,把交聯(lián)酶聚集體技術(shù)和水相原位聚合技術(shù)相結(jié)合制備了CLEAs凝膠。通過對制備工藝條件的優(yōu)化,CLEAs凝膠的酶活保留率可達(dá)62.7%。形態(tài)結(jié)構(gòu)表征結(jié)果顯示,所制備的CLEAs凝膠的平均粒徑約為50.390μm,聚合物殼層厚度在700nm左右。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,CLEAs凝膠的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及有機(jī)溶劑耐受性相比于游離酶和CLEAs得到顯著提高。在連續(xù)催化紅景天苷的合成反應(yīng)中,CLEAs凝膠仍能夠保持較高的催化合成效率,其催化效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于游離酶和CLEAs。(5)以天然杏仁粗粉作為β-葡萄糖苷酶載體,基于水相原位聚合技術(shù)成功制備了杏仁粉凝膠,其催化活性為天然杏仁粉的78.8%。通過形態(tài)結(jié)構(gòu)表征分析可知,所制備的杏仁粉凝膠的平均粒徑約為45.437μm,表面聚合物殼層厚度僅有460nm。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,表面具有聚合物殼層的杏仁粉凝膠在酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性以及重復(fù)操作穩(wěn)定性等方面相比于天然杏仁粉都得到了顯著提高。在連續(xù)進(jìn)行5個(gè)批次反應(yīng)合成紅景天苷時(shí),紅景天苷的平均收率可達(dá)16.1%,而其平均催化合成能力為3.63g/(L·U),與天然杏仁粉相比杏仁粉凝膠表現(xiàn)出絕對的生產(chǎn)優(yōu)勢,因此具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：安徽工程大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q814.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2513958