【摘要】：肽聚糖是組成微生物細胞壁的主要成分,它對細胞完整性,細胞形態(tài)及耐受滲透壓有著重要的作用。肽聚糖代謝包括合成代謝和降解代謝,代謝過程需要一系列的酶共同完成,缺一不可。在致病性大腸桿菌O157中,有40%-50%的肽聚糖水解產(chǎn)物會被重新利用合成肽聚糖。肽聚糖酰胺酶MpaA作用于胞壁質(zhì)三肽(Mtp)L-Ala-γ-D-Glu-meso-DAP,負責切割γ-D-Glu與meso-DAP之間的酰胺鍵。若MpaA活性降低或喪失,則會影響Mtp降解,最終導(dǎo)致肽聚糖合成受到抑制進而影響菌體正常生長。細菌內(nèi)D-型氨基酸含量很低,且通常由相應(yīng)的L-型氨基酸通過消旋酶作用生成,谷氨酸/天冬氨酸消旋酶AspR負責將L-Glu或L-Asp通過消旋作用生成相應(yīng)的D-Glu或D-Asp。D-Glu是肽聚糖組成不可或缺的成分。如果D-Glu合成受阻,會使肽聚糖合成受到阻滯,影響肽聚糖的完整性及自身正常生長,嚴重時會導(dǎo)致菌體死亡。本論文致力于解析肽聚糖酰胺酶MpaA與谷氨酸/天冬氨酸消旋酶AspR的三維結(jié)構(gòu),闡明結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。通過克隆基因和構(gòu)建表達載體、純化重組蛋白并結(jié)晶、收集高分辨率晶體衍射數(shù)據(jù)、解析蛋白三維結(jié)構(gòu)系等一系列工作闡明MpaA和AspR結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。MpaA和AspR均是潛在的小分子藥物作用靶點,本論文的研究結(jié)果將為新型小分子藥物的研發(fā)提供結(jié)構(gòu)學(xué)數(shù)據(jù)。MpaA晶體結(jié)構(gòu)分辨率2.6?。每個不對稱單元含有兩個蛋白單體分子,每個單體分子含有一個Zn2+。MpaA蛋白單體分子由7個α-螺旋和10個β-折疊組成,呈現(xiàn)金屬羧肽酶典型的α/β構(gòu)象。在氨基酸序列保守性分析基礎(chǔ)上,通過比較MpaA、Vh-MpaA和CPA1活性中心,發(fā)現(xiàn):活性中心高度保守,催化氨基酸和Zn2+離子配位氨基酸完全保守,這意味著MpaA的催化反應(yīng)機制與金屬羧肽酶超家族蛋白相同。在MpaA中含有兩個重要的loop結(jié)構(gòu):Tyr133-Asp143loop和Val204-Thr211 loop。其中,Tyr133-Asp143 loop柔性強,發(fā)揮活性腔蓋子作用,負責調(diào)節(jié)底物Mtp進入與結(jié)合;Val204-Thr211 loop結(jié)構(gòu)有序,影響底物結(jié)合的特異性。谷氨酸/天冬氨酸消旋酶AspR游離態(tài)晶體分辨率為1.6?,每個不對稱單元含有一個蛋白分子,AspR單體蛋白分子含有兩個結(jié)構(gòu)域:N端結(jié)構(gòu)域(N1-C101和N216-C228)和C端結(jié)構(gòu)域(N102-C215)。每個結(jié)構(gòu)域均為α/β折疊方式。底物結(jié)合態(tài)AspR-L-Asp復(fù)合物和產(chǎn)物結(jié)合態(tài)AspR-D-Asp復(fù)合物的晶體分辨率分別為1.76?和1.59?。將游離態(tài)AspR與底物結(jié)合態(tài)或產(chǎn)物結(jié)合態(tài)的AspR進行疊合發(fā)現(xiàn):當產(chǎn)物或底物結(jié)合時,AspR不發(fā)生構(gòu)象的開關(guān)變化。AspR活性中心有獨特催化對Thr83-Cys197,此催化對不同于典型的Cys-Cys催化對。在底物結(jié)合態(tài)復(fù)合物中,底物L-Asp的α-碳原子直接朝向催化對中的Cys197,而在產(chǎn)物結(jié)合態(tài)復(fù)合物中,產(chǎn)物D-Asp的α-碳原子則朝向了催化對中的Thr83。在分析Cys197-巰基和Thr83-羥基活潑性的基礎(chǔ)上,本論文首次從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度闡明了AspR消旋反應(yīng)單向性的催化機理。
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【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q936

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1 馬銀良;大腸桿菌O157中MpaA蛋白和AspR蛋白的三維結(jié)構(gòu)測定與功能研究[D];河北大學(xué);2017年

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本文編號：2468714