【摘要】：為解決生物技術(shù)藥物半衰期短的問(wèn)題,各種長(zhǎng)效化策略相繼開(kāi)發(fā)并成功應(yīng)用于多種蛋白藥物。聚乙二醇(PEG)修飾藥物蛋白,能夠顯著延長(zhǎng)半衰期,降低免疫原性,同時(shí)提高藥物水溶性和穩(wěn)定性。偶聯(lián)PEG分子,可增大藥物蛋白的水力學(xué)半徑,從而減緩腎小球?yàn)V出速率,延長(zhǎng)藥物半衰期;另外一種方法是借助新生兒Fc受體(FcRn)介導(dǎo)的再循環(huán)途徑,延長(zhǎng)藥物蛋白的半衰期。本論文針對(duì)這兩種策略,開(kāi)發(fā)了一種新型的巰基定點(diǎn)的PEG修飾試劑;拓展了白蛋白結(jié)合肽(ABD)融合表達(dá)的長(zhǎng)效策略,并對(duì)兩種重要的長(zhǎng)效策略進(jìn)行詳細(xì)比較。巰基定點(diǎn)修飾對(duì)于實(shí)現(xiàn)高度選擇性修飾、保證批次間重復(fù)性有著重要價(jià)值,已成為PEG修飾的重要方法。然而現(xiàn)有的巰基修飾試劑存在穩(wěn)定性差、反應(yīng)活性低、偶聯(lián)產(chǎn)物易發(fā)生PEG脫落等問(wèn)題。本論文利用鄰苯二酚類化合物與巰基官能團(tuán)的特異性反應(yīng),將鄰苯二酚與PEG偶聯(lián)制備一種新型的巰基定點(diǎn)修飾試劑(PEG-DAQ)。首先,利用有無(wú)游離巰基的同種突變蛋白,及巰基是否被N-乙基馬來(lái)酰亞胺封閉的同一種蛋白確認(rèn)了 PEG-DAQ的巰基定點(diǎn)選擇性;通過(guò)對(duì)睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、鞭毛蛋白突變體(CBLB502-Cys)和牛血清白蛋白(BSA)三種含巰基蛋白進(jìn)行修飾反應(yīng),證實(shí)了該修飾劑的普適性;通過(guò)對(duì)比PEG-DAQ與常用的巰基修飾試劑PEG-MAL、PEG-VS的修飾效率,發(fā)現(xiàn)PEG-DAQ具有反應(yīng)活性高的優(yōu)點(diǎn),其修飾率與PEG-MAL相近,且遠(yuǎn)高于PEG-VS;考察修飾試劑PEG-DAQ在不同pH條件下反應(yīng),發(fā)現(xiàn)在pH5.5-8.5之間均可以進(jìn)行修飾反應(yīng),pH越高,修飾效率也越高。進(jìn)一步,考察了修飾劑的穩(wěn)定性,當(dāng)PEG-DAQ在水溶液放置96h后,其修飾能力保持了幾乎100%;與之對(duì)照的PEG-MAL,修飾能力僅有最初的70%。以CNTF作為模型蛋白,對(duì)修飾劑的應(yīng)用做進(jìn)一步研究。經(jīng)PEG-DAQ修飾后分離純化得到單修飾樣品,經(jīng)過(guò)圓二色光譜和熒光光譜確認(rèn),PEG-DAQ修飾的CNTF與原蛋白的二三級(jí)結(jié)構(gòu)保持一致;考察修飾產(chǎn)物穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)PEG-DAQ修飾產(chǎn)物在37℃放置2周,單修飾產(chǎn)物存留率達(dá)93.5%;而PEG-MAL修飾產(chǎn)物僅保留71.2%。TF-1.CN5a.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 PEG的親水柔性鏈?zhǔn)笴NTF的體外活性降低,但兩種修飾試劑PEG-DAQ和PEG-MAL的修飾產(chǎn)物細(xì)胞活性沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明了 PGE-DAQ不存在明顯的細(xì)胞毒性;SD大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 PEG-DAQ-CNTF半衰期延長(zhǎng)為原蛋白的3倍。因此,本論文的研究提供了一種新型巰基定點(diǎn)修飾試劑PEG-DAQ,這一修飾劑有著廣泛的應(yīng)用前景。人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的蛋白。HSA可以與FcRn受體結(jié)合,并借助其介導(dǎo)的再循環(huán)途徑避免被胞內(nèi)溶酶體水解,半衰期可達(dá)19天。治療性蛋白可與HSA融合表達(dá)以此延長(zhǎng)藥物蛋白的半衰期。這種融合表達(dá)策略無(wú)需化學(xué)修飾及修飾后的純化步驟,工藝簡(jiǎn)單,且產(chǎn)品均一性好。然而,與大分子量的白蛋白融合,一些治療性的融合蛋白往往難以在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),需要真核表達(dá)系統(tǒng),存在表達(dá)量低,成本高的問(wèn)題。而小分子量的白蛋白結(jié)合肽(ABD)可以特異性的與白蛋白結(jié)合,借助白蛋白的穩(wěn)定性和長(zhǎng)效性,同樣可以實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)藥物半衰期的目的。本論文利用這一原理,構(gòu)建ABD與人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)融合蛋白,通過(guò)原核體系表達(dá)制備ABD-CNTF,并與不同分子量的PEG修飾CNTF做對(duì)比,比較其藥物作用的半衰期變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),融合蛋白ABD-CNTF為可溶表達(dá),表達(dá)量為90-100 mg/L發(fā)酵液;經(jīng)過(guò)兩步層析純化,純度為95%以上。SEC實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ABD-CNTF保留了 ABD與HSA結(jié)合的能力,且結(jié)合可在數(shù)分鐘(10min)內(nèi)完成;圓二色光譜和熒光光譜表明ABD-CNTF保留了原蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。TF-1.CN5a.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明ABD-CNTF保留了 90%以上的原蛋白細(xì)胞活性;與之對(duì)照的是,PEG修飾CNTF損失了絕大部分細(xì)胞活性,PEG-40k-CNTF的細(xì)胞活性小于原蛋白的10%。最后,SD大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 ABD-CNTF半衰期延長(zhǎng)14倍,延長(zhǎng)效果介于PEG-20k與PEG-40k之間。研究結(jié)果表明,ABD融合藥用蛋白是一種低廉有效的制備長(zhǎng)效蛋白藥物的新方向。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q51
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本文編號(hào)：2461795