【摘要】：肝受體同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1,NR5A2),隸屬于核受體NR(nuclear receptor)5A亞家族,是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。LRH-1的結(jié)構(gòu)在脊椎動(dòng)物中十分保守。其在機(jī)體代謝、發(fā)育、膽汁酸動(dòng)態(tài)平衡和類固醇生成中起著重要的作用。LRH-1在垂體、腎上腺、脂肪、胰腺、肝臟、腸道、精巢、卵巢等器官中表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中,LRH-1主要表達(dá)在各發(fā)育階段卵巢的濾泡顆粒細(xì)胞(Granulosa cells)和黃體細(xì)胞中,在鞘膜細(xì)胞(Theca cells)中沒有表達(dá);在精巢生殖細(xì)胞和萊氏細(xì)胞(Leydig cells)中有表達(dá),在支持細(xì)胞(Sertoli cells)中沒有表達(dá)。在小鼠中,LRH-1純合敲除致死。雜合突變雄鼠的附睪和精囊體重比正常小鼠低,Star、Scc、3β-HSD等類固醇生成因子表達(dá)含量下降;雜合突變LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等類固醇基因表達(dá)水平降低而導(dǎo)致小鼠不能排卵。顆粒細(xì)胞特異性條件敲除LRH-1雌鼠不育,不能排卵。在硬骨魚類中,利用RT-PCR的方法證實(shí)了LRH-1在腦、垂體、鰓絲、鰾、肝臟、腸道、脂肪、血液、卵巢以及腎臟和頭腎中均有表達(dá)。在石斑魚中,LRH-1表達(dá)在卵巢的濾泡細(xì)胞和生殖細(xì)胞中。有體外實(shí)驗(yàn)證明LRH-1可以結(jié)合在cyp19a1a和cyp19a1b的啟動(dòng)子上并激活它們的表達(dá)。在脊椎動(dòng)物中,至今沒有LRH-1在小鼠以外的功能研究報(bào)道,也沒有對(duì)羅非魚LRH-1的表達(dá)和功能進(jìn)行系統(tǒng)的研究報(bào)道。在本研究中,利用RT-PCR,Western blot以及免疫組織化學(xué)方法研究了LRH-1在羅非魚不同組織和雌雄性腺不同發(fā)育階段中的表達(dá)以及細(xì)胞定位;并利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)尼羅羅非魚中的LRH-1進(jìn)行突變,獲得了F0代陽性魚和F1代雜合子,進(jìn)一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究結(jié)果如下:通過中山大學(xué)張為民教授實(shí)驗(yàn)室獲得斑點(diǎn)石斑魚LRH-1抗體,利用ClustalX軟件對(duì)用于制作石斑魚LRH-1多克隆抗體的抗原氨基酸序列(172-288)和羅非魚的LRH-1相應(yīng)蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)石斑魚抗原部分98%的氨基酸序列都可以比對(duì)到羅非魚的蛋白氨基酸序列上。證明石斑魚的LRH-1抗體可以用來檢測(cè)羅非魚的LRH-1蛋白。我們通過Western blot結(jié)果顯示:石斑魚的LRH-1多克隆抗體能特異識(shí)別羅非魚的LRH-1天然蛋白(85 kDa),并發(fā)現(xiàn)LRH-1在羅非魚的精巢、卵巢中均有一條主帶,且在心臟、腦、肝臟中表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示LRH-1可在羅非魚腦、鰓絲、心臟、脾、肝臟、腸、卵巢、精巢、肌肉等組織中表達(dá)。此外,免疫組化結(jié)果顯示:LRH-1主要表達(dá)在早期生殖細(xì)胞和類固醇生成細(xì)胞,在卵巢中表達(dá)于卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和鞘膜細(xì)胞,在精巢中表達(dá)于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和萊氏細(xì)胞。且LRH-1與Cyp19a1a/Cyp17a1/Cyp17a2共表達(dá)于卵巢的間質(zhì)細(xì)胞和鞘膜細(xì)胞。LRH-1和Sf-1表達(dá)模式基本一致。利用CRISPR/Cas9技術(shù)在尼羅羅非魚突變LRH-1基因,獲得F0代XX與XY的陽性魚,尾鰭突變率最高為98%,最低為50%。對(duì)F0代陽性魚分析表明:與對(duì)照XX雌魚相比,120 dah時(shí),XX陽性魚卵巢出現(xiàn)空腔,且Cyp19a1a/cyp19a1a、scc、starI表達(dá)下調(diào)。同時(shí),通過EIA檢測(cè)顯示,XX陽性魚雌激素水平下調(diào);210dah時(shí),XX陽性魚卵巢相比對(duì)照組卵巢表現(xiàn)為發(fā)育延遲,卵巢中還保留大量類固醇陽性細(xì)胞。通過LRH-1突變的陽性F0代XY雄魚與野生型XX雌魚雜交產(chǎn)生F1代雜合子LRH-1+/-。性腺組織檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照雌魚相比,在90 dah LRH-1+/-XX雌魚卵巢中,間質(zhì)細(xì)胞減少,Cyp19a1a/cyp19a1a表達(dá)下調(diào),雌激素水平下調(diào)。在210 dah LRH-1+/-XX雌魚卵巢中,卵子發(fā)育延遲,有大量卵母細(xì)胞停留在I、II時(shí)相,遲遲不能積累卵黃,且有空腔出現(xiàn),卵巢性腺成熟系數(shù)(GSI)顯著降低;與對(duì)照XY雄魚相比,90 dah時(shí),LRH-1+/-XY雄魚精巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,但在180 dah時(shí)精巢內(nèi)部恢復(fù)正常,產(chǎn)生的精子可育。精巢芳香化酶Cyp19a1b/cyp19a1b表達(dá)下調(diào),雌激素水平下調(diào),雄激素水平?jīng)]有顯著變化。由于F1代雌魚不育,所以嘗試用兩種方法建立LRH-1純合突變魚,第一種方法為用F0代LRH-1突變雌魚和F0代突變雄魚雜交,嘗試在雜交后代中篩選純合子;第二種方法為用F0代突變雌魚和F1代突變雄魚雜交,嘗試在雜交后代中篩選純合子,但酶切結(jié)果顯示雜交后代均為雜合子和野生型,沒有發(fā)現(xiàn)純合子,表明純合突變致死。綜上所述,本研究結(jié)果證實(shí)在羅非魚性腺中LRH-1的表達(dá)模式與哺乳動(dòng)物基本一致:在生殖細(xì)胞和類固醇生成細(xì)胞中表達(dá)。并且在硬骨魚類雌激素生成和卵子生成中具有重要作用。這反映出LRH-1在脊椎動(dòng)物中的表達(dá)和功能具有保守性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q953

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2382881