【摘要】：目的:實驗動物是生命科學研究的基礎和條件,實驗動物作為人類的替身承擔藥物安全和治療效果,其質量直接影響眾多領域科學實驗的準確性。隨著我國科研水平的不斷提高,研究人員對實驗動物的微生物質量控制要求越來越嚴格。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、多殺巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、支氣管鮑特桿菌(Bordetella bronchiseptica)、肺支原體(Mycoplasma pneumoniae)、泰澤氏菌(clostridium piliformis)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)等七種病原體是我國實驗動物微生物質量控制需要排除的病原體,也是實驗動物常見的易感病原體。目前對實驗動物攜帶的病原體主要依靠分離純化培養(yǎng)、菌落形態(tài)、鏡下觀察及生化試驗等方法進行鑒定,檢測周期長,費用高,并且需要有經驗的檢測人員進行判定,漏檢、誤判時有發(fā)生。PCR(Polymerase Chain Reaction)技術以其簡便、快速、準確等優(yōu)點已廣泛用于醫(yī)療和衛(wèi)生行業(yè),但實驗動物的微生物質量控制還未將PCR檢測方法納入,更沒有多重PCR方法,這已成為多種病原體或大樣本簡單、快速、準確鑒定的掣肘。多重PCR(multiplex PCR)可以在同一反應體系中擴增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高效等優(yōu)點。用于實驗動物病原微生物檢測,可以同時檢測多種病原體,適合大樣本的檢測與鑒定,具有高靈敏性、高特異性和低成本等優(yōu)點。多重PCR在其他行業(yè)應用較多,然而,目前應用在實驗動物病原微生物檢測的研究很少。本研究目的是針對七種實驗動物病原菌金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體、泰澤氏菌、肺炎克雷伯桿菌,建立多重PCR檢測方法,并與傳統(tǒng)的微生物檢測方法或血清學方法比較,驗證多重PCR檢測方法的可操作性和準確性。方法:1、標準菌株的培養(yǎng)和DNA提取:將金黃色葡萄球菌標準株接種到SP瓊脂培養(yǎng)基,綠膿桿菌標準株接種到NAC瓊脂培養(yǎng)基,肺炎克雷伯桿菌接種到dhl瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)18-24h;多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌接種到血瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24-48h;肺支原體接種到液體培養(yǎng)基中,一周后進行觀察收集。按照細菌提取試劑盒方法提取各種病原體的dna,泰澤氏菌dna由中國食品藥品檢定研究院惠贈。2、引物的設計:通過查閱文獻和primer5.0軟件設計金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體和泰澤氏菌的特異性引物,使用blast分析引物特異性;進行pcr擴增,測序鑒定。3、特異性實驗和敏感性實驗:pcr擴增非目的菌進行特異性實驗;將模板dna按照10倍的比例進行梯度稀釋,檢測pcr敏感性。4、四組多重pcr檢測方法的建立和初步應用4.1將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌三種細菌在同一個反應體系中擴增,同時加入16srrna的引物作為內質控,優(yōu)化多重反應體系和擴增條件,驗證該多重體系的特異性和敏感性。應用該多重反應體系檢測人工感染的糞便樣本和76例新鮮大、小鼠糞便樣本,同時采用傳統(tǒng)檢測方法進行檢測。4.2將多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體三種病原微生物在同一個反應體系中擴增,驗證該多重體系的特異性和敏感性,建立多重反應體系。應用該多重反應體系檢測人工感染的氣管分泌物、棉拭子樣本和182例實驗動物樣本,同時采用傳統(tǒng)檢測方法或血清學方法進行檢測。4.3將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌和肺支原體五種病原微生物在同一個反應體系中擴增,優(yōu)化多重反應體系和擴增條件,驗證該多重體系的特異性和敏感性,建立多重反應體系,應用該多重反應體系檢測人工感染病原菌的糞便、氣管分泌物、棉拭子和182例實驗動物樣本,同時采用傳統(tǒng)檢測方法或血清學方法進行檢測。4.4將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和泰澤氏菌三種細菌在同一個反應體系中擴增,驗證該多重體系的特異性和敏感性,建立多重反應體系。應用該多重反應體系檢測112例實驗動物糞便樣本,同時采用傳統(tǒng)檢測方法或血清學方法進行檢測。結果:1、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、多殺巴氏桿菌和支氣管鮑特桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上生長,肺支原體液體培養(yǎng)顏色由紅色變?yōu)辄S色。2、獲得10對特異性引物,并通過blast比對驗證引物的特異性,擴增產物大小分別為金黃色葡萄球菌(153bp)、綠膿桿菌(600bp)、肺炎克雷伯桿菌(368bp)、通用引物(520bp)、多殺巴氏桿菌(356bp)、支氣管鮑特桿菌(237bp)、肺支原體(266bp)、泰澤氏菌(639bp)、綠膿桿菌(197bp),擴增產物測序結果均與genebank中相應序列一致。3、pcr特異性和敏感性實驗:金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體和泰澤氏菌特異性實驗結果,除標準菌株擴增出陽性條帶外,其它菌種均擴增陰性。敏感性實驗:金黃色葡萄球菌dna檢測最低限為1pg;綠膿桿菌dna檢測最低限為10pg;肺炎克雷伯桿菌dna檢測最低限為10pg;多殺巴氏桿菌dna檢測最低限為1pg;支氣管鮑特桿菌dna檢測最低限為10pg;肺支原體dna檢測最低限為1pg;泰澤氏菌dna檢測最低限為100pg,對應的拷貝數600copies/μl。4、四組多重pcr檢測方法:4.1建立金黃色葡萄球菌(153bp)、綠膿桿菌(600bp)、肺炎克雷伯桿菌(368bp)和16srrna(520bp)的多重pcr檢測方法。應用多重pcr方法檢測人工感染病原菌樣本,檢測結果均陽性;76份大、小鼠糞便樣本多重pcr檢測結果顯示1份小鼠糞便樣本綠膿桿菌陽性,其余樣本檢測陰性;傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法檢測結果與多重pcr檢測結果一致。4.2建立多殺巴氏桿菌(356bp)、支氣管鮑特桿菌(237bp)、肺支原體(266bp)的多重pcr檢測方法;應用多重pcr方法檢測人工感染的氣管分泌物、棉拭子樣本,檢測結果均陽性;182例大小鼠、兔棉拭子樣本多重pcr檢測結果19例兔棉拭子樣本多殺巴氏桿菌陽性,9例大鼠棉拭子肺支原體陽性;多殺巴氏桿菌和支氣管鮑特桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法檢測結果全部陰性,肺支原體血清學方法檢測9例陽性。4.3建立金黃色葡萄球菌(153bp)、綠膿桿菌(600bp)、多殺巴氏桿菌(356bp)、支氣管鮑特桿菌(237bp)和肺支原體(266bp)的多重pcr檢測方法;應用多重pcr方法檢測人工感染的糞便、氣管分泌物和棉拭子樣本,檢測結果均陽性;182例大小鼠、兔糞便和棉拭子樣本多重PCR檢測結果1例小鼠糞便綠膿桿菌陽性;傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法檢測結果與多重PCR結果一致,肺支原體血清學方法檢測肺支原體全部陰性。4.4建立金黃色葡萄球菌(153bp)、綠膿桿菌(197bp)和泰澤氏菌(639bp)的多重PCR檢測方法。應用多重PCR方法檢測112例大小鼠、兔糞便樣本檢測結果全部陰性,傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法檢測金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌結果陰性,血清學方法檢測泰澤氏菌全部陰性。結論:針對七種病原體金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體、泰澤氏菌和肺炎克雷伯桿菌,根據病原菌特點和檢測取材方法,分別建立了四組多重PCR檢測方法。四種組合均有良好的敏感性和特異性,人工感染的樣本均檢測結果陽性。多重PCR檢測方法的初步應用顯示,多重PCR具有良好的可操作性和準確性,檢測結果與傳統(tǒng)培養(yǎng)或血清學檢測方法一致,有些樣本傳統(tǒng)培養(yǎng)方法或血清學檢測方法未檢測出的,但多重PCR體系檢測出陽性結果。本方法的建立為今后多重PCR應用于實驗動物微生物的檢測奠定了基礎。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q95-331

【參考文獻】

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本文編號：2266181