【摘要】：肉桂醇脫氫酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)催化松柏醛生成松柏醇,是華細辛主要藥理活性成分甲基丁香酚生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。分離CAD基因并進行功能驗證是調(diào)控華細辛甲基丁香酚生物合成的基礎(chǔ)工作。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選到華細辛7個可能的CAD基因轉(zhuǎn)錄本(AsGAD1～7),同時通過同源克隆獲得1個華細辛CAD基因(AsCAD);對上述8個基因進行了生物信息學(xué)分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,初步預(yù)測了華細辛CAD基因家族成員的特征;利用實時熒光定量PCR篩選出華細辛在不同生長時期及不同組織中進行基因表達定量分析時適宜的內(nèi)參基因18SrRNA,在此基礎(chǔ)上,進行AsCADs差異表達分析;利用Gateway技術(shù)構(gòu)建AsCAD基因過表達載體pK7FWG2.0-AsGAD,通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,檢測木質(zhì)素含量,驗證基因功能。主要研究結(jié)果如下:(1)基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選出7個可能的華細辛GAD家族成員,分別命名為AsCAD1～7,向NCBI提交后,在GenBank中的登陸號分別為KY446440～KY446446。利用生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件對AsCADs所編碼蛋白的一級、二級、三級結(jié)構(gòu)以及功能進行分析,結(jié)果表明,AsCAD1～7分子量在30 kD～40 kD之間,屬于酸性不穩(wěn)定親水蛋白質(zhì),無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽,且空間結(jié)構(gòu)較保守,具有Zin1、Zin2和NADPH結(jié)構(gòu)域,屬于MDR超家族成員。(2)基于同源克隆的原理和方法,利用PCR和RACE擴增技術(shù),分離得到1個華細辛CAD cDNA全長,共1357 bp,命名為AsCAD(GenBank登陸號為KT454711)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,AsGAD屬于CAD家族成員,與AsCAD2基因序列一致性達到96.14%,推測是具有功能的候選基因。(3)利用實時熒光定量PCR以及分析軟件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT等,從 SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP-2、GAPDH和TUB 6個候選內(nèi)參基因中篩選華細辛在不同生長時期(營養(yǎng)生長期、花期、花后期)及不同組織中(根、根莖、葉片、葉柄、花)表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因,結(jié)果表明18SrRNA在各個時期表達均比較穩(wěn)定,是進行華細辛基因差異表達分析適宜的內(nèi)參基因。(4)利用實時熒光定量PCR相對定量法,對AsCADs進行差異表達分析,結(jié)果表明,在華細辛生長發(fā)育過程中,AsCADs在根、根莖、葉片、葉柄和花中均有表達,但表達量不同,AsCAD3與AsCAD6表達量都相對較少。總體上,同一組織中,基因表達量呈現(xiàn)出營養(yǎng)生長期花期花后期的趨勢。同一時期中,AsCAD1與AsCAD的表達模式相一致,均為地下部分(根與根莖)表達量高于地上部分(葉片與葉柄)表達量,AsCAD2與AsCADA在各組織的表達量差異較大,AsGAD5在根中的表達量最高,在葉片中的表達量最低,AsGAD7在各組織表達無明顯差異,AsCAD在各組織表達水平均比較高。A5CADs表達水平的差異暗示基因功能的多樣性。(5)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建AsCAD過表達載體pK7FWG2.0-AsCAD,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥�？剐院Y選以及PCR檢測結(jié)果表明,成功獲得了AsCAD過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性轉(zhuǎn)化株。木質(zhì)素含量測定結(jié)果進一步顯示,轉(zhuǎn)基因植株主莖木質(zhì)素含量較野生型植株提高了 2.96%,增幅達到32.74%,整株植物木質(zhì)素含量提高了 3.20%,增幅達到38.60%,說明AsCAD參與了植物木質(zhì)素的生物合成,具有酶活性。本研究從華細辛中挖掘得到AsCADs,對其進行了差異表達分析和功能驗證,為下階段轉(zhuǎn)化擬南芥進行RNAi抑制表達、轉(zhuǎn)化華細辛進行同源表達,以及闡明甲基丁香酚生物合成分子調(diào)控機制奠定了工作基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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本文編號：2255131