【摘要】：目前,越來越多的植物乳桿菌被證實為益生菌。植物乳桿菌具有諸多有利于人體健康的生理功能。除此之外,植物乳桿菌在工業(yè)上的應用也引起了人們越來越多的關注。然而在這些應用中,植物乳桿菌會遭遇高鹽濃度。植物乳桿菌運用諸多策略來應對不利的滲透壓條件。盡管已經(jīng)有一些關于植物乳桿菌滲透壓反應的研究,目前對這方面的的理解還是有限的。本研究以不同來源的植物乳桿菌ATCC14917、植物乳桿菌FS5-5和植物乳桿菌208為研究對象,繪制了其在無NaCl培養(yǎng)基中的生長曲線,然后收集對數(shù)期菌體使其分別在NaCl濃度為0%、24%(w/v)培養(yǎng)基中應激3h,運用iTRAQ研究了其在兩種鹽應激下的蛋白質表達情況,最后運用RT-qPCR技術對所選差異蛋白質的基因表達進行了驗證。1.通過測定其OD600nm分別繪制了它們在無NaCl培養(yǎng)基中的生長曲線。由生長曲線可知,植物乳桿菌ATCC14917、植物乳桿菌FS5-5和植物乳桿菌208在無NaCl培養(yǎng)基中,生長至對數(shù)生長期中期的時間點分別為5h、5h和6h。2.收集三株植物乳桿菌在無NaCl培養(yǎng)基中生長至對數(shù)生長期中期的菌體進行鹽應激試驗。然后收集菌體,進行iTRAQ試驗。試驗結果表明:在uniprot_taxonomy_1578庫中鑒定到350957個譜圖,匹配上16669個譜圖,鑒定到1628個肽段種類,匹配上878個蛋白質。3.以差異倍數(shù)在1.2倍以上,且P-value0.05為篩選條件對三株植物乳桿菌在NaCl濃度為24%與0%(w/v)相比、0%(w/v)相比和24%(w/v)相比出現(xiàn)的差異蛋白質點進行篩選,共篩選出867個差異蛋白質點。在所有比較中上調蛋白質點和下調蛋白質點均是植物乳桿菌ATCC14917植物乳桿菌FS5-5植物乳桿菌208,并且植物乳桿菌ATCC14917與植物乳桿菌FS5-5的上調蛋白質點和下調蛋白質點個數(shù)相差較小,而均與植物乳桿菌208相差較大。4.通過 Gene ontology(GO)數(shù)據(jù)庫和 Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫對差異蛋白質進行功能和代謝通路的注釋,然后再對三株植物乳桿菌的注釋差異蛋白質進行比較。結果再次說明植物乳桿菌ATCC14917與植物乳桿菌FS5-5的上調蛋白質點和下調蛋白質點個數(shù)相差較小,而均與植物乳桿菌208相差較大。這可能說明植物乳桿菌ATCC14917的鹽應激能力與植物乳桿菌FS5-5的鹽應激能力相當,植物乳桿菌208的鹽應激能力較差。因此,不同來源的三株植物乳桿菌的鹽應激能力有差異。在鹽應激條件下,表達水平明顯變化的蛋白質主要為參與糖代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝、蛋白質合成、應激反應和轉運的蛋白。5.應用RT-qPCR技術對iTRAQ試驗中所選差異蛋白質進行基因表達水平的驗證試驗。結果表明,基因表達水平與蛋白質表達水平基本一致,這在RNA水平上驗證了iTRAQ結果的準確性。
[Abstract]:At present, more and more Lactobacillus plantarum have been confirmed as probiotics. Lactobacillus plantarum has many physiological functions beneficial to human health. In addition, the application of Lactobacillus plantarum in industry has attracted more and more attention. In these applications, however, Lactobacillus plantarum suffers from high salt concentrations. Lactobacillus plantarum uses a number of strategies to cope with adverse osmotic conditions. Although there have been some studies on the osmotic response of Lactobacillus plantarum, the understanding is limited. In this study, the growth curves of Lactobacillus plantarum ATCC14917, and Lactobacillus plantarum FS5-5 and Lactobacillus plantarum 208 from different sources in NaCl free medium were drawn. Then we collected the bacteria in logarithmic phase to stress them in 0 ~ 24% (w / v) NaCl medium for 3 h, studied their protein expression under two kinds of salt stress by iTRAQ. Finally, the gene expression of the selected differential protein was verified by RT-qPCR technique. 1. Their growth curves in NaCl free medium were plotted by measuring their OD600nm. According to the growth curve, the growth time points of Lactobacillus plantarum ATCC14917, Lactobacillus plantarum FS5-5 and Lactobacillus plantarum 208 in NaCl free medium were 5 h / 5 h and 6 h 路2 h respectively. Three strains of Lactobacillus plantarum were collected to grow to the middle stage of logarithmic growth in NaCl free medium for salt stress test. Then the bacteria were collected and iTRAQ test was carried out. The results showed that 350957 spectra were identified in uniprot_taxonomy_1578 library, 16669 spectra were matched, 1628 peptides were identified and 878 proteins were matched. Three strains of Lactobacillus plantarum were screened at 24% of NaCl concentration compared with 0% (w / v) and 24% (w / v) compared with 0% (w / v). A total of 867 differentially expressed protein spots were screened by using P-value0.05 as the screening condition and the multiple of difference was more than 1.2.The results showed that three strains of Lactobacillus plantarum had different protein spots compared with 0% (w / v) and 24% (w / v) respectively. In all the comparisons, the up-regulated and down-regulated protein spots were Lactobacillus plantarum ATCC14917, Lactobacillus plantarum FS5-5, Lactobacillus plantarum FS5-5, and the number of up-regulated protein spots and down-regulated protein spots of Lactobacillus plantarum ATCC14917 and Lactobacillus plantarum FS5-5 were smaller than those of Lactobacillus plantarum. The difference between the two groups was larger than that of Lactobacillus plantarum 208. The functional and metabolic pathways of differential proteins were annotated by Gene ontology (GO) database and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) database, and then the annotated differential proteins of three strains of Lactobacillus plantarum were compared. The results showed that the number of up-regulated protein spots and down-regulated protein spots of Lactobacillus plantarum ATCC14917 and Lactobacillus plantarum FS5-5 were smaller than those of Lactobacillus plantarum FS5-5. This may indicate that the salt stress ability of Lactobacillus plantarum ATCC14917 is equal to that of Lactobacillus plantarum FS5-5, and the salt stress ability of Lactobacillus plantarum 208 is poor. Therefore, the salt stress ability of three Lactobacillus plantarum strains from different sources is different. Under salt stress, the main proteins involved in glucose metabolism, amino acid metabolism, nucleotide metabolism, protein synthesis, stress response and transport were protein. RT-qPCR technique was used to verify the gene expression level of differential protein in iTRAQ test. The results showed that the gene expression level was basically the same as the protein expression level, which verified the accuracy of the iTRAQ results at the RNA level.
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q936

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