本文選題：曲霉孢子 + 葡萄糖氧化酶�。� 參考：《中南林業(yè)科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：孢子是生物體產(chǎn)生的一種具有繁殖或休眠作用的特殊生命形式,能在惡劣的環(huán)境下保持自有的傳播能力,并再在有利條件下直接發(fā)育成新個(gè)體。盡管孢子被認(rèn)為是代謝惰性的,但它們卻是極好的酶貯藏庫和非常有前景的生物催化劑,更是生命繁殖的重要階段,研究孢子萌發(fā)中的活性物質(zhì)變化可為有效利用或控制其活體提供理論基礎(chǔ)。常規(guī)的研究方法如光度法、色譜法所需儀器龐大、能耗高、昂貴,且不能進(jìn)行對(duì)活體實(shí)時(shí)、原位研究。電化學(xué)方法具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快速等特點(diǎn),掃描電化學(xué)顯微分析在實(shí)現(xiàn)生物體系實(shí)時(shí)、原位、無損以及在線分析的同時(shí),還可進(jìn)行微區(qū)生物活性成分分析,基于此,我們提出采用電化學(xué)方法研究孢子萌發(fā)過程中活性成分的新方法及新思路。本文以食品、醫(yī)藥、化工、生物技術(shù)等行業(yè)中有廣泛應(yīng)用的微生物來源葡萄糖氧化酶(Glocose oxidase,GOx)為研究對(duì)象,采用電化學(xué)方法研究了曲霉孢子的不同生長(zhǎng)階段的GOx活性,為進(jìn)一步開發(fā)曲霉孢子作為GOx生物催化劑,或作為有害曲霉菌的抑制靶點(diǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐,具體結(jié)果如下:(1)建立定量檢測(cè)GOx酶活的電化學(xué)循環(huán)伏安方法。巧妙地引入二茂鐵甲醇(Ferrocene methanol,Fc)作為氧化還原探針,獲取GOx催化反應(yīng)中的電子傳遞信號(hào),以玻碳電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極、鉑絲電極為對(duì)電極,對(duì)不同酶濃度的磷酸緩沖溶液,采用循環(huán)伏安法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,在酶濃度為0.128～2.377 U/mL的范圍內(nèi),響應(yīng)峰電流與酶濃度之間具有良好的線性關(guān)系,其回歸方程為:I[10-5A]=4.427.E[U]+14.054,相關(guān)系數(shù)為0.998,檢測(cè)下限為0.128 U/mL。采用樣品加標(biāo)法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),回收率在97.208%～104.538%之間。在采用電化學(xué)方法的同時(shí)采用傳統(tǒng)的滴定法測(cè)定酶活進(jìn)行對(duì)照,結(jié)果表明,循環(huán)伏安法檢測(cè)GOx酶活力準(zhǔn)確可靠,且操作更加簡(jiǎn)便快速。(2)電化學(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定黑曲霉孢子萌發(fā)過程中GOx酶活�；谏险陆⒌碾娀瘜W(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定GOx酶活的方法,提出電化學(xué)循環(huán)伏安法測(cè)定黑曲霉孢子中GOx酶活的原理與方法,并將該法應(yīng)用于測(cè)定黑曲霉孢子萌發(fā)過程中GOx酶活性的變化,同時(shí)采用生物顯微鏡觀察了黑曲霉孢子的生長(zhǎng)情況,獲得了黑曲霉孢子萌發(fā)過程中的GOx酶活變化。結(jié)果表明,在96孔板中培養(yǎng)0～4 h,孢子還未萌發(fā),孢子的酶活力沒有明顯變化。在第4～10 h,孢子迅速萌發(fā),孢子的GOx酶活力逐漸增強(qiáng),在第8 h達(dá)到最高為2.13 U/mL。第10～16 h,孢子萌發(fā)完全,孢子的GOx酶活力又恢復(fù)到最初的水平。同時(shí)使用滴定法進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示兩種方法結(jié)果近似。(3)掃描電化學(xué)顯微鏡(Scanning Electrochemical Microscope,SECM)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)黃曲霉單孢子萌發(fā)過程的形貌和GOx酶活變化�；谘h(huán)伏安法檢測(cè)GOx的原理,結(jié)合SECM,實(shí)時(shí)、在線研究了黃曲霉孢子萌發(fā)過程中的形貌與GOx酶活變化。用聚苯乙烯的培養(yǎng)皿固定黃曲霉孢子,以Fc作為氧化還原介質(zhì),10 μm的鉑微電極為探針,銀/氯化銀為參比電極,鉑絲電極為輔助電極,利用SECM技術(shù)對(duì)單個(gè)黃曲霉孢子進(jìn)行成像,觀測(cè)黃曲霉孢子從休眠到萌發(fā)過程中的形貌,同時(shí)檢測(cè)萌發(fā)過程中的GOx活性變化。結(jié)果表明,隨著孢子萌發(fā),孢子形狀變化為由近似圓球到一側(cè)慢慢長(zhǎng)出凸起的萌發(fā)管的過程。當(dāng)孢子開始萌發(fā),孢內(nèi)的GOx復(fù)蘇,同時(shí)孢膜退化,通透性增強(qiáng),Fc與葡萄糖能夠進(jìn)入孢子內(nèi)與復(fù)蘇的GOx進(jìn)行氧化還原反應(yīng),使得探針檢測(cè)到的孢子中心電流增強(qiáng)。
[Abstract]:In this paper , we propose a new method for quantitative detection of active ingredient in spore germination . The results are as follows : ( 1 ) The method of electrochemical microscopic analysis is characterized by high sensitivity , good selectivity , rapid response , etc . A method for the determination of GOx enzyme activity in spores of Aspergillus niger was studied by electrochemical cyclic voltammetry . The results showed that the activity of GOx in Aspergillus niger spores was determined by cyclic voltammetry . ( 3 ) Scanning electrochemical microscopy ( SECM ) was used to monitor the morphology of spore germination and the changes of GOx activity in the process of spore germination .
【學(xué)位授予單位】：中南林業(yè)科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q936;O657.1
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本文編號(hào)：2118492