本文選題：坦布蘇病毒 + rFX2010-MM1775-EDⅢ��； 參考：《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：自鴨坦布蘇病毒病2010年在中國爆發(fā)以來,給我國的養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展帶來了嚴重的影響。該病主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋率嚴重下降,食欲下降、高熱、運動障礙等臨床癥狀,嚴重的還可以致鴨子死亡。2010年上海獸醫(yī)研究所在當?shù)氐镍唸龇蛛x到了一株坦布蘇病毒,命名為FX2010,并與早期在馬來西亞地區(qū)蚊子體內(nèi)分離到的MM1775株做了比較,并深入研究了該毒株的生物學特性。在復制能力、感染性和在鴨間的接觸傳播能力等生物特性兩株病毒存在一定的差異,導致坦布蘇病毒感染鴨子后所表現(xiàn)的不同的生物學特性,但其分子機制目前尚不清楚。E蛋白是坦布蘇病毒的囊膜糖蛋白,分為3個結(jié)構(gòu)域(Domain),其中,DomainⅢ的作用是介導病毒與受體蛋白的結(jié)合,與病毒的感染性密切相關(guān)。通過比對FX2010和rMM1775的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)E DomainⅢ(EDⅢ)有2個氨基酸不同,分別位于E312和E332。為了探究這兩個位點的差異是否導致了兩株病毒感染性不同的差異。本研究使用分子克隆和PCR定點突變技術(shù)分別構(gòu)建FX2010-E/V312A/T332S和MM1775-E/A312V/S332T兩個E基因突變質(zhì)粒,然后利用上海獸醫(yī)研究所已經(jīng)建立的反向遺傳系統(tǒng)通過融合PCR技術(shù)擴增得到5'末端含有T7啟動子序列的病毒全長cDNA。以上述得到的cDNA為模板,經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄成RNA,將此RNA再轉(zhuǎn)染DF-1細胞,48小時后觀察細胞是否出現(xiàn)特征性病變,如果有病變,當病變達到90%以上,取細胞上清液100ul,再接種DF-1細胞,72小時后細胞仍然出現(xiàn)特征性病變,經(jīng)間接免疫熒光試驗(IFA)檢測有熒光,隨后分段RT-PCR擴增可以獲得涵蓋病毒全基因組的所有特異性條帶。經(jīng)序列測定、比對,拯救的E基因定點突變病毒的基因序列與預望的完全一致,表明E基因定點突變病毒拯救成功,分別命名為 rFX2010-MM1775-EDⅢ和 rMM1775-FX2010-EDⅢ。進一步對rFX2010-MM1775-EDⅢ和rMM1775-FX2010-EDⅢ對鴨子的感染性進行研究。將103.5TCID50rFX2010-MM1775-EDⅢ經(jīng)肌肉接種鴨子后4天,可在接種鴨子的脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、腦中檢測到較高滴度的病毒,同群接觸鴨在同群接觸后7天、14天血清抗體均呈陽性,表明其可以接觸感染同群鴨;將103.5TCID50rMM1775-FX2010-EDⅢ 經(jīng)肌肉接種鴨子 4 天后,僅在肝臟、脾臟中檢測到了病毒,同群接觸鴨在同群接觸后7天、14天血清抗體均呈陰性,其結(jié)果顯示說明該毒株不能接觸感染同群鴨。推斷可能EDⅢ區(qū)域不是控制傳播能力的主要基因或者是與某個區(qū)域共同來控制其傳播能力,還需以后的實驗來繼續(xù)研究。
[Abstract]:Since the outbreak of duck tambusuvirus in China in 2010, it has had a serious impact on the development of duck breeding in China. The disease is characterized by a severe drop in laying rate, decreased appetite, high fever, dyskinesia and other clinical symptoms, as well as death in ducks. In 2010, the Shanghai Veterinary Research Institute isolated a Tambusuvirus strain from a local duck farm. It was named FX2010 and compared with MM1775 strain isolated from mosquitoes in Malaysia, and the biological characteristics of the strain were studied. The biological characteristics of the two viruses, such as replication ability, infectious ability and contact transmission ability between ducks, are different, which leads to different biological characteristics of Tambusuvirus infection in ducks. However, the molecular mechanism of .E protein is not clear, which is the envelope glycoprotein of Tambusuvirus, which is divided into three domains: Domainia. Domain 鈪，

本文編號：2007383