本文選題：家蠶 + 滯育　； 參考：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：滯育是昆蟲為適應(yīng)不良環(huán)境而形成的一種在卵、幼蟲、蛹或成蟲期發(fā)育停滯的生理現(xiàn)象,對(duì)昆蟲生存和繁殖具有重要意義。鱗翅目模式昆蟲家蠶是卵滯育的典型代表,但其滯育的分子機(jī)制仍未徹底闡明。研究表明,家蠶咽下神經(jīng)節(jié)分泌的滯育激素(diapause hormone,DH)是誘導(dǎo)蠶卵滯育的主要因素,DH通過滯育激素受體(diapause hormone receptor,DHR)傳遞信號(hào)并最終決定卵的滯育。加強(qiáng)DH和DHR的功能及作用機(jī)制研究,有助加深我們對(duì)家蠶卵滯育機(jī)制的了解,并為家蠶育種和卵滯育害蟲防控提供理論參考。有關(guān)家蠶滯育的分子生物學(xué)研究,主要集中在相關(guān)基因的鑒定、表達(dá)和生理生化分析等方面,鮮有基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究報(bào)道。本論文以DH及其受體DHR1為靶標(biāo),利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和GAL4/UAS雙元表達(dá)工具,在多化性家蠶品系Nistari(Nis)中過表達(dá)DH和DHR1基因,研究它們對(duì)多化性家蠶胚胎滯育的影響,取得的主要結(jié)果如下:1.DH和DHR1基因的鑒定及克隆從家蠶中鑒定并克隆了DH和DHR1基因的CDS序列。測(cè)序結(jié)果表明:DH基因CDS序列長(zhǎng)579 bp,編碼192個(gè)氨基酸,編碼蛋白含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域;DHR1基因CDS序列全長(zhǎng)1311 bp,編碼436個(gè)氨基酸,含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。2.DH和DHR1基礎(chǔ)轉(zhuǎn)基因系的制作構(gòu)建了用于過表達(dá)DH和DHR1基因的piggyBac表達(dá)載體pB[A4-GAL4,3×P3DsRed]、pB[UASDH,3×P3EGFP]和pB[UASDHR1,3×P3EGFP]。將該3個(gè)載體質(zhì)粒顯微注射至Nis早期胚胎,通過熒光篩選獲得了相應(yīng)的G1代陽性蛾圈,分別命名為A4G4、UASDH和UASDHR1。經(jīng)反向PCR和基因組PCR方法檢測(cè)確認(rèn),3個(gè)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)基因系制作成功。3.過表達(dá)DH和DHR1轉(zhuǎn)基因系的制作將A4G4轉(zhuǎn)基因系分別與UASDH和UASDHR1轉(zhuǎn)基因系雜交,通過對(duì)雜交后代個(gè)體進(jìn)行雙熒光篩選,獲得了過表達(dá)DH和DHR1的陽性雜交后代,分別命名為A4G4/UASDH和A4G4/UASDHR1。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,DH和DHR1基因均顯著上調(diào)表達(dá),表明轉(zhuǎn)基因過表達(dá)系制作成功。4.過表達(dá)DH轉(zhuǎn)基因蠶的表型及相關(guān)基因分析利用qRT-PCR技術(shù),首先對(duì)A4G4/UASDH個(gè)體中DH基因的時(shí)期表達(dá)特征進(jìn)行分析,結(jié)果表明:DH在蛹6天和9天各有一個(gè)表達(dá)高峰,其中蛹6天峰值最高,暗示蛹6天是DH決定家蠶卵滯育與否的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。隨后對(duì)DH下游的滯育相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:過表達(dá)DH對(duì)8個(gè)滯育相關(guān)基因的表達(dá)均有不同程度的影響,其中對(duì)DHR1、TRE1、TRE2、OXR1、SDH1和SDH2ab的時(shí)期表達(dá)有明顯影響,對(duì)EA4和TRPA1的影響相對(duì)最小。對(duì)A4G4/UASDH的55個(gè)自交后代卵圈進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),有7個(gè)卵圈出現(xiàn)了滯育。該結(jié)果表明,在多化性家蠶品系中過表達(dá)DH基因,能夠影響滯育相關(guān)基因的表達(dá),但不足以使其后代蠶卵全部表現(xiàn)為滯育特性。5.過表達(dá)DHR1轉(zhuǎn)基因蠶的表型及相關(guān)基因分析利用qRT-PCR技術(shù),對(duì)A4G4/UASDHR1個(gè)體中DHR1基因的時(shí)期表達(dá)特征進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:DHR1在蛹6天和9天各有一個(gè)表達(dá)高峰,其中蛹6天峰值最高,暗示蛹6天是DHR1參與決定家蠶卵滯育的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。進(jìn)一步對(duì)DHR1下游的滯育相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明:過表達(dá)DHR1對(duì)7個(gè)滯育相關(guān)基因的表達(dá)均有不同程度的影響,其中對(duì)TRE1和TRE2的影響相對(duì)較大,發(fā)生表達(dá)變化的時(shí)期主要在蛹后期和蛾期;對(duì)OXR1、SDH1、SDH2ab、EA4和TRPA1的表達(dá)影響相對(duì)較小。對(duì)A4G4/UASDHR1的59個(gè)自交后代卵圈進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),所有卵圈均未出現(xiàn)滯育。該結(jié)果表明,在多化性家蠶品系中過表達(dá)DHR1基因,能夠影響滯育相關(guān)基因的表達(dá),但并不能使其后代蠶卵表現(xiàn)為滯育特性。
[Abstract]:DH and DHR1 genes were identified and cloned from silkworm . The results showed that the DH and DHR1 genes were cloned from silkworm .
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q963

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1973173