本文選題：15kDa硒蛋白 + 熱休克轉(zhuǎn)錄因子��； 參考：《深圳大學》2017年碩士論文

【摘要】：硒元素在生物體內(nèi)的功能主要通過各種硒蛋白實現(xiàn)的。15 kDa硒蛋白(Sep15)是人體中25種硒蛋白之一,目前對Sep15的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究未見報道。本研究主要從轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制以及Sep15在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的功能進行研究,來探討Sep15的生物學功能。本研究通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn),人Sep15基因上游-2055/-248存在熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)的結(jié)合位點,提示Sep15的基因表達可能受到HSF1的調(diào)控。將含有Sep15的核心啟動子區(qū)域:-818/-248片段的熒光素酶報告基因的啟動子活性檢測載體(pGL4)和HSF1,共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)(DLR)、實時熒光定量(Q-PCR)和蛋白免疫印跡(WB)分別檢測Sep15的核心啟動子活性、mRNA水平和蛋白水平。結(jié)果顯示,過表達HSF1能增強Sep15的核心啟動子活性、促進Sep15的轉(zhuǎn)錄,提高Sep15的蛋白表達水平。通過染色質(zhì)免疫共沉淀方法(CHIP)驗證了HSF1能結(jié)合到Sep15啟動子上的5個片段,且其中一個在核心啟動子上。熱激能夠誘導HSF1入核調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。將細胞進行熱激處理后,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)(DLR)、實時熒光定量(Q-PCR)和蛋白免疫印跡(WB)分別檢測Sep15的核心啟動子活性、mRNA水平和蛋白水平。結(jié)果顯示,熱激能增強Sep15的核心啟動子活性、促進Sep15的轉(zhuǎn)錄,提高Sep15的蛋白表達水平。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑衣霉素(Tm)能夠上調(diào)Sep15表達,且通過復雜的信號通路誘導HSF1調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達。Tm處理細胞后,運用雙熒光素酶報告系統(tǒng)(DLR)、實時熒光定量(Q-PCR)和蛋白免疫印跡(WB)分別檢測Sep15的核心啟動子活性、mRNA水平和蛋白水平。結(jié)果顯示,與過表達HSF1結(jié)果類似,Tm處理顯著提高了Sep15的核心啟動子活性;在Tm處理的同時過表達HSF1,對核心啟動子活性提高的效果進一步增強。在HEK293T細胞中,Sep15的轉(zhuǎn)錄水平隨著Tm處理時間的延長而提高;而在N2a細胞中,Sep15的轉(zhuǎn)錄水平隨著Tm處理時間先升高后降低。同時,蛋白免疫印跡檢測Sep15表達結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平的變化一致,表明Tm處理引起的Sep15轉(zhuǎn)錄與表達變化具有細胞特異性。放線菌素D會抑制mRNA的合成。放線菌素D的處理結(jié)果顯示,Tm處理是通過提高Sep15轉(zhuǎn)錄水平,進而促進Sep15的蛋白表達。CHIP結(jié)果顯示,Tm處理后,可能誘導HSF1入核,與Sep15啟動子結(jié)合,調(diào)節(jié)Sep15轉(zhuǎn)錄,進而提高Sep15的蛋白水平,從而參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制或其它生物學事件,促進細胞存活。綜上所述,在過表達HSF1或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下,HSF1入核結(jié)合Sep15啟動子區(qū)域,調(diào)節(jié)Sep15轉(zhuǎn)錄,促進Sep15表達。而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下,Sep15與自噬相關(guān)蛋白LC3表達趨勢相似,預示其可能是促存活機制中的一個重要成員。
[Abstract]:The function of selenium in vivo is mainly realized by various selenoproteins. Sep15) is one of the 25 kinds of selenium proteins in human body. So far, the transcriptional regulation of Sep15 has not been reported. In order to explore the biological function of Sep15, the mechanism of transcriptional regulation and the function of Sep15 in endoplasmic reticulum (ER) were studied in this study. In this study, bioinformatics predicted that there was a binding site of heat shock transcription factor 1HSF1 (-2055 / -248) in the upstream of human Sep15 gene, suggesting that the gene expression of Sep15 might be regulated by HSF1. The promoter activity detection vector pGL4 of luciferase reporter gene containing the core promoter region of Sep15: -818 / -248 and HSF1 were co-transfected into HEK293T cells. Double luciferase reporting system (DLRX), real-time fluorescence quantitative quantitation (Q-PCR) and Western blot (Western blot) were used to detect the mRNA level and protein level of core promoter of Sep15. The results showed that overexpression of HSF1 could enhance the core promoter activity of Sep15, promote the transcription of Sep15 and increase the expression of Sep15 protein. Five fragments of HSF1 binding to Sep15 promoter were confirmed by chromatin immunoprecipitation method, and one of them was on core promoter. Heat shock can induce HSF1 into the nucleus to regulate the transcription of related genes. After heat shock treatment, Sep15 core promoter activity mRNA and protein level were detected by double luciferase report system (DLRX), real-time fluorescence quantitative quantitation (Q-PCR) and Western blotting (Western blot), respectively. The results showed that heat shock could enhance the core promoter activity of Sep15, promote the transcription of Sep15 and increase the expression of Sep15 protein. Endoplasmic reticulum stress inducer (Tm) can up-regulate the expression of Sep15, and induce HSF1 to regulate the expression of related genes through complex signaling pathway. Double luciferase reporting system (DLRX), real-time fluorescence quantitative quantitation (Q-PCR) and Western blot (Western blot) were used to detect the mRNA level and protein level of core promoter of Sep15. The results showed that the activity of core promoter of Sep15 was significantly increased by Tm treatment similar to that of overexpression of HSF1, and the activity of core promoter was further enhanced by over-expression of HSF1 at the same time of TM treatment. The transcriptional level of HEK293T cells increased with the prolongation of TM treatment time, while in N2a cells, it increased first and then decreased with TM treatment time. At the same time, the results of Sep15 expression by Western blot were consistent with the changes of transcription level, which indicated that the changes of Sep15 transcription and expression induced by TM treatment were cell-specific. Actinomycin D inhibits the synthesis of mRNA. The results of actinomycin D treatment showed that Tm treatment enhanced the Sep15 transcription level, and then promoted the expression of Sep15 protein. Chip results showed that HSF1 might be induced into the nucleus, bind to Sep15 promoter and regulate Sep15 transcription after treatment with TM. Furthermore, the protein level of Sep15 was increased, which involved in the quality control of endoplasmic reticulum or other biological events, and promoted cell survival. In conclusion, under the stress of overexpression of HSF1 or endoplasmic reticulum (ER) stress, HSF1 is involved in nucleation-binding Sep15 promoter, which regulates the transcription of Sep15 and promotes the expression of Sep15. Under endoplasmic reticulum stress, the expression trend of LC3 was similar to that of autophagy related protein LC3, suggesting that it might be an important member of survival promotion mechanism.
【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1957783