本文選題：枯草芽孢桿菌 + 突變體　； 參考：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：枯草桿菌漆酶是一種藍(lán)色多銅氧化酶,它能夠參與木質(zhì)素的降解,并且催化多種芳胺類小分子物質(zhì)的氧化,是一種環(huán)境友好型酶。本論文從原始的產(chǎn)漆酶菌株CAR2出發(fā),通過(guò)紫外線誘變的方法得到具有較高漆酶活性的菌株ZNXH1,兩者所產(chǎn)漆酶分別為CAR2(R155)、CAHH1(R155H、M157H、A158T),而后者的催化活力明顯高于前者。為了建立漆酶功能與結(jié)構(gòu)的相關(guān)性,我們利用定點(diǎn)突變的方法在漆酶的第二保守區(qū)選定了155、157、158三個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn),設(shè)計(jì)并獲得了六種突變體漆酶:CAW(R155W)、CAWH(R155W,M157H)、CAWH1(R155H、M157H、A158E)、CAHE(R155H、A158E)、CAHH(R155H、M157H)和CAH2(R155H),其中CAR2、CAH2(R155H)為共享的原始漆酶和對(duì)照突變體漆酶。上述八種漆酶在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了有效的活性表達(dá),其分子量均約為66 kDa。對(duì)上述八種漆酶的性質(zhì)與功能進(jìn)行了對(duì)比分析,取得如下結(jié)果:(1)CAHH1及所有六種突變體漆酶(CAW、CAWH、CAWH1、CAHE、CAHH、CAH2)的催化活力均高于野生型漆酶CAR2,其中尤以CAHH1及CAHH的催化活力為高,其次為CAH2與CAWH,說(shuō)明枯草桿菌漆酶的His155、His157、Thr158位點(diǎn)對(duì)漆酶活性有明顯的正效應(yīng)或?qū)τ谄崦傅拇呋钚允潜匦璧?(2)除野生型菌株CAR2的最適溫度為50℃,另外七種漆酶的最適溫度均為60℃,而且CAHH1、CAHH、CAH2的熱穩(wěn)定性最高,其次是CAWH1與CAHE,它們?cè)?0-80℃下孵育1h后,均可以保持約70%以上的活力,說(shuō)明枯草桿菌漆酶的His155、His157位點(diǎn)對(duì)漆酶的熱穩(wěn)定性也有較大的貢獻(xiàn);(3)野生型漆酶CAR2的最適pH為4.0,剩余七種漆酶的最適pH為4.6,說(shuō)明CAHH1與所有突變體漆酶的催化條件略有堿移,這顯然對(duì)漆酶的應(yīng)用是有益的。W155類突變體漆酶(CAW、CAWH、CAWH1)的酸堿穩(wěn)定性明顯高于其它漆酶,說(shuō)明W155位點(diǎn)對(duì)提高漆酶的酸堿穩(wěn)定性,特別是在弱堿性條件下的穩(wěn)定性有明顯貢獻(xiàn);(4)Co~(2+)、Mn~(2+)和Mg~(2+)對(duì)漆酶有激活作用,其中Mn~(2+)的激活作用最為顯著;(5)動(dòng)力學(xué)分析表明,His155、His157、Glu158/Thr158位點(diǎn)對(duì)提高漆酶的催化效率是有利或必須的;(6)在漆酶通用介體ABTS存在下,原始漆酶和突變體漆酶均在3 h之內(nèi)可以使靛藍(lán)胭脂紅(蒽醌類)、剛果紅(偶氮類)、結(jié)晶紫(三苯甲烷類)染料有效脫色,脫色率達(dá)70%以上,其中CAHH和CAHH1對(duì)靛藍(lán)胭脂紅和剛果紅的脫色率達(dá)到了90%以上,對(duì)結(jié)晶紫的脫色率可達(dá)80%以上,然而所有漆酶對(duì)活性亮藍(lán)(蒽醌類)、甲基紅(偶氮類)的脫色效果較低(低于20%),說(shuō)明漆酶的第二保守區(qū)對(duì)漆酶催化的底物有一定的選擇性,同時(shí)His155、His157、Thr158位點(diǎn)對(duì)提高漆酶的應(yīng)用性也是有利的。另一方面,所有漆酶對(duì)靛藍(lán)胭脂紅的脫色均不依賴介體ABTS的存在,但催化結(jié)晶紫時(shí)確是非常依賴介體ABTS存在的。在有Mn~(2+)存在的條件下,除了原始漆酶CAR2外,其它漆酶對(duì)靛藍(lán)胭脂紅、剛果紅和結(jié)晶紫的脫色率均有明顯提高,催化3 h后,脫色率均接近100%,其中突變漆酶CAHH和CAHH1對(duì)結(jié)晶紫的脫色率效力最高,作用1.5 h后達(dá)到100%。這些結(jié)果說(shuō)明,這些漆酶,尤其是第二組(CAWH、CAWH1、CAHE)和第三組漆酶(CAHH1、CAHH、CAH2)有望成為有潛力的工業(yè)用酶�？傮w上來(lái)說(shuō),我們得到的突變體漆酶CAHH和CAHH1在比活力、熱穩(wěn)定性以及脫色率、對(duì)環(huán)境的敏感性等方面都表現(xiàn)較突出的特性,更好的滿足了工業(yè)需要。通過(guò)對(duì)漆酶第二保守區(qū)關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸殘基的設(shè)計(jì)改造,通過(guò)對(duì)比分析所有漆酶在活力、溫度穩(wěn)定性以及脫色率、對(duì)環(huán)境的敏感性等方面的差異,建立了漆酶在該區(qū)域的結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性,為提高漆酶的應(yīng)用性,并針對(duì)不同的目的及漆酶應(yīng)用條件,設(shè)計(jì)出不同的高效漆酶等奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Bacillus subtilis laccase is a kind of blue poly copper oxidase, which can participate in the degradation of lignin and catalyze the oxidation of a variety of small aromatic amines. It is a kind of environment-friendly enzyme. From the original laccase producing strain CAR2, the strain ZNXH1 with high laccase activity was obtained by ultraviolet mutagenesis. Both of them were produced. Laccase was CAR2 (R155), CAHH1 (R155H, M157H, A158T), and the catalytic activity of the latter was significantly higher than that of the former. In order to establish the correlation between the function and structure of laccase, we selected 155157158 three key loci in the second conservative region of laccase, and designed and obtained six mutant laccase, CAW (R155W), CAWH (R155). W, M157H), CAWH1 (R155H, M157H, A158E), CAHE (R155H, A158E), CAHH (R155H, M157H) and the control mutant laccase. These eight laccase are active in Escherichia coli, with a molecular weight of about 66 of the eight laccase properties and functions of the above mentioned laccase The results are as follows: (1) the catalytic activity of CAHH1 and all six mutant laccase (CAW, CAWH, CAWH1, CAHE, CAHH, CAH2) is higher than that of the wild type laccase CAR2, especially the catalytic activity of CAHH1 and CAHH is higher, followed by CAH2 and CAWH, indicating that the laccase activity has obvious positive effect on laccase activity. The catalytic activity of the laccase is necessary. (2) the optimum temperature of the wild type strain CAR2 is 50, the optimum temperature of the other seven laccase is 60, and the thermal stability of CAHH1, CAHH and CAH2 is the highest, followed by CAWH1 and CAHE. After incubating 1H at 40-80 degrees, they can all maintain about 70% of the vitality, indicating the laccase of Bacillus subtilis. His155, His157 loci also have a great contribution to the thermal stability of laccase, (3) the optimum pH of the wild type laccase CAR2 is 4, the optimum pH of the remaining seven laccase is 4.6, indicating that the catalytic condition of the laccase with all the mutant laccase is slightly alkaline, and the application of the laccase is obviously acidic and stable of the beneficial.W155 mutant laccase (CAW, CAWH, CAWH1). The qualitative significantly higher than other laccase, indicating that the W155 site has a significant contribution to improving the stability of the laccase acid base, especially in the weak alkali conditions. (4) Co~ (2+), Mn~ (2+) and Mg~ (2+) have the activation effect on laccase, and Mn~ (2+) is most significant; (5) kinetic analysis shows that His155, His157, Glu158/Thr158 loci are to be extracted. The catalytic efficiency of high laccase is beneficial or necessary. (6) in the presence of laccase general medium ABTS, the original laccase and mutant laccase can make indigo carmine (anthraquinone), Congo red (azo) and crystal violet (triphenyl methane) dyestuff in 3 h, and the decolorization rate is more than 70%, of which CAHH and CAHH1 are to indigo carmine and Congo The decolorization rate of red is above 90% and the decolorization rate of crystal violet is above 80%. However, the decolorization effect of all laccase to active blue (anthraquinone) and methyl red (azo) is lower (less than 20%). It shows that the second conserved area of laccase is selective to the substrate of laccase catalyzed by laccase. At the same time, the His155, His157 and Thr158 loci can improve laccase. Application is also beneficial. On the other hand, all laccase decolorization of indigo carmine does not depend on the presence of mediator ABTS, but the catalytic crystal violet depends very much on the presence of mediator ABTS. In the presence of Mn~ (2+), the decolorization rate of indigo carmine, Congo red and crystal violet is evident in addition to the original laccase CAR2. The decolorization rate was close to 100% after 3 h catalysis, in which the mutant laccase CAHH and CAHH1 had the highest decolorization effect on crystal violet. After 1.5 h, the results showed that the laccase, especially the second groups (CAWH, CAWH1, CAHE) and third groups of laccase (CAHH1, CAHH, CAH2) were expected to be potential industrial enzymes. The mutant laccase CAHH and CAHH1 showed prominent characteristics in the specific activity, thermal stability, decolorization rate and environmental sensitivity, and better meet the industrial needs. Through the design and transformation of the amino acid residues at the key site of the laccase second conserved region, all laccase was compared and analyzed in vitality and temperature stability by comparison and analysis. The correlation between the structure and function of laccase in this area was established for the difference of the decolorization rate and the sensitivity to the environment. It laid the foundation for improving the application of laccase and designing different high efficiency laccase for different purposes and the application conditions of laccase.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q936

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本文編號(hào)：1910602